ICS 07.080 G 66 中华人民共和国国家标准 GB/T 34799—2017 几丁质酶活性检测方法 Determination of the activity of chitinase 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34799—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、四川省卫生和计划生育监督 执法总队、深圳市职业技术学院。 本标准主要起草人：李碧芳、赖心田、卢杰、张世伟、周李华、刘冬、林霖、唐栋、王士峰、陈血建、刘斌、 杨国武。 GB/T 34799—2017 几丁质酶活性检测方法 1范围 本标准规定了黏质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）、灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）和绿色木 霉（Trichodermaviride）发酵生产的几丁质酶活性检测方法。 本标准适用于生化试剂、工业产品中几丁质酶活性的测定 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 几丁质酶活性单位 chitinase activity unit 在37℃，pH6.0时，通过β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶辅助的两步反应，每分钟催化生成1mgN-乙 酰葡萄糖的儿丁质酶量为一个活力单位，单位为U。 4 原理 几丁质酶能迅速催化几丁质水解为N-乙酰葡萄糖或由N-乙酰葡萄糖构成的双糖和寡糖，双糖和 寡糖在βN-乙酰氨基葡萄糖苷酶的辅助下继续水解为可由吸光度法检测的N-乙酰葡萄糖.通过外标 法计算N-乙酰葡萄糖生成量测得酶活性。 5 仪器设备及器具 5.1pH计：0.01级。 5.2电子天平：感量0.0001g。 5.3分光光度计：吸光度值精确至0.001 5.41cm石英比色皿。 5.5恒温震荡摇床：控温精度0.5℃。 6 试剂 本标准所使用的试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682中规定的二级水。 1 GB/T34799—2017 6.1溶液A：200mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0 磷酸氢二钾0.459g，磷酸二氢钾2.36g，加入90mL水，用1mol/L的氢氧化钾或盐酸调节pH至 6.0，定容至100mL。 6.2溶液B:12.5mg/mL几丁质悬浊液 称取粉末状几丁质5.0g，缓慢加人200mL（≤4℃）预冷的37%的盐酸中，在磁力搅拌器上剧烈搅 拌，待几丁质基本上溶解完毕且溶液变为清亮的黄色时，于4℃冰箱沉淀过夜。将上清液倒人 2000mL的水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30min后停止搅拌，将悬浮液置于4℃冰 箱沉淀过夜。倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，至滤液pH达到5.5 以上。将上述沉淀物加到50mL的水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质悬浊液。取该悬浊液 前剧烈震荡摇匀，用溶液A稀释至12.5mg/mL。 6.3溶液C:2.5mol/L酒石酸钾钠溶液 称取28.22g四水酒石酸钾钠（KNaC,H,O，·4HzO)，加人40mL的2mol/L氢氧化钠溶液。 100℃水浴加热，不可直接煮沸。 6.4溶液D：96mmol/L3,5-二硝基水杨酸溶液 称取1.1g的3，5-二硝基水杨酸（3，5-DinitrosalicylicAcid），加人50mL水，100℃水浴加热溶解， 不可直接煮沸。 6.5溶液E：显色试剂溶液 缓慢搅拌将溶液C和溶液D混匀。用水稀释到100mL。若未完全溶解，试剂应该在混匀时溶解。 试剂置于棕色瓶中，室温保存，稳定保存6个月。 6.6溶液F：10mmol/L对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷溶液（PNP-NAG) 称取342.3mg对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（p-NitrophenylN-Acetyl-β-D Glucosaminide,PNP-NAG)，用水定容至100mL。 6.7溶液G:β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶溶液 用溶液A配置βN-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-Acetylglucosaminidase）的溶液，现用现配，并按以 下方法调整酶浓度：所有试剂使用前在37℃恒温箱中平衡30min。取1μLβ-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 溶液加入1.25mL溶液A中，再加人1.25mL溶液F，快速混匀后于分光光度计400nm波长下，测定 之间。 称取0.05g的N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-Acetyl-D-Glucosamine，NAG），用水定容至100mL。 2