ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34738—2017 蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法 Method of the real-time PCR for the detection of honey bees sacbrood disease 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34738—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、吉林大学、中华人民共和国福建出人境 检验检疫局。 本标准起草人：宋战昀、冯新、孟日增、刘金华、魏春艳、牟峻、王振国、郑腾、孟庆峰、蔡阳、肖成蕊、 王伟利。 1 GB/T 34738—2017 蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法。 本标准适用于蜜蜂及其幼虫中囊状幼虫病的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 试剂和材料 3 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用焦碳酸二乙酯水处理 后高压灭菌)分装。 3.1水,GB/T6682,三级。 3.2蜜蜂囊状幼虫病毒 3.3引物和探针，上游引物F1(10pmol/μL）：5²-AAGTTGGAGGCGCGYATTTG-3'，下游引物 5"-FAM-CGG AGT GGA AAG AT-TAMRA-3'。 3.4 磷酸盐缓冲盐水，配制方法见A.1。 3.5总RNA抽提试剂。 3.6 氯仿。 3.7 异丙醇。 3.8 75%乙醇。 注：用新开启的无水乙醇和焦碳酸二乙酯水配制。 3.9 焦碳酸二乙酯处理的水。 反转录酶。 3.10 3.11RNA酶抑制剂（40U/μL)。 3.12 5×反转录酶缓冲液。 3.13 10×PCR反应缓冲液（含镁离子）。 3.14 ：DNA聚合酶（5U/μL）。 3.15 三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNPTs每种浓度均为1ommol/L）。 4器材 4.1 荧光定量PCR扩增仪。 1 GB/T34738—2017 4.2 台式冷冻高速离心机（离心速度12000r/min以上）。 4.3微量可调移液器（100μL~1000u、20μL~200μL、2μL~20L、0.5μL~10μL）及配套带滤芯 吸头。 4.4研钵。 4.5涡旋震荡器。 4.6恒温水浴锅。 4.7离心管（1.5mL）。 4.8 3PCR管。 5现场检验 5.1临床特征 开箱，提蜂脾查看，出现下列病理变化特征之一者，可判为疑似： a） 脾面上会出现卵、小幼虫、大幼虫、封盖子排列不规则的现象，即所谓“花子脾”现象 b) 病害严重时，病虫多，工蜂清理不及，可以在脾面上见到病虫巢房被工蜂咬开，巢房盖有大量不 规则孔洞，露出患病幼虫上翘的头部呈“尖头”状，其头部有大量的透明液体聚积。 c) 用镊子小心夹住幼虫头部将其提出，可见虫体末端明显的囊状袋，虫体苍白色、无味、无黏性， 参见附录B。 5.2 鉴别诊断 在临床诊断时应注意将本病与美洲幼虫腐臭病相区别，其鉴别诊断要点参见附录B。 6实验室诊断 6.1样品采集 a）蜂巢内病变区域成蜂20只～30只，或 b）不小于20cm²的蜂房，或 c）取临近蜂巢的蜂蜜、花粉及小幼虫和底部的王浆等蜜蜂食物（30g～50g）。 6.1.2采集的样品分别装人无菌的容器中，加人5倍～10倍样品体积的RNA保存液，尽快转移到液氮 中保存，供检测用。 6.2 2样品处理 6.2.1在洁净、灭菌并烘干的研钵内，加入蜜蜂3只～5只（或幼虫3只～5只，或蜂房10g左右，或蜜 蜂食物10g左右），同时加人PBS(10mL）和RNA酶抑制剂（终浓度为100U/mL），混匀并充分研磨。 6.2.24℃、3000r/min离心15min。 6.2.3取上清液，转入无菌离心管（1.5mL）中，编号备用。 6.3 荧光RT-PCR 6.3.1阳性对照与阴性对照 阴、阳性样品的制备方法见附录C。 2 SZG