ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34756—2017 猪轮状病毒病 病毒RT-PCR检测方法 Porcine rotavirus diseaseRT-PCR for detecting virus acid 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34756—2017 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAT/TC181)归口。 本标准起草单位：东北农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、河南牧业经济学院 本标准起草人：乔薪瑷、邵卫星、魏荣、崔文、唐丽杰、李一经、姜艳平、孙映雪、李卫华、徐耀辉。 GB/T 34756—2017 猪轮状病毒病 病毒RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪轮状病毒RT-PCR检测方法的试剂、仪器设备、操作程序。 本标准适用于猪临床样品（新鲜粪便和小肠）及细胞培养物中猪轮状病毒核酸的检测。 2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AMV.鸟类RNA病毒反转录酶(avianmyeloblastosisvirus) bp：碱基对（basepair) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsalinebuffer） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RNA：核糖核酸(ribonucleic acid) RRI:RNA酶抑制剂(RNase ribonucleaseinhibitor) RT：反转录(reverse transcriptase) RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reversetranscriptase-polymerasechainreaction） Taq酶:Taq DNA聚合酶（Taq DNApolymerase) 3 3试剂 除另有规定外，所用试剂应为分析纯。提取病毒RNA所用试剂应使用无RNA酶的容器进行 分装。 3.1氯仿：常温保存。 3.2 2异丙醇。 3.3 75%乙醇。 3.4 二乙基焦磷酰胺（DEPC）。 3.5 Taq酶。 3.6 AMV. 3.7 DNA分子量标准（DL2000bp）。 3.8 电泳缓冲液（TAE)（配制见A.1)。 3.9 1.5%琼脂糖（配制见A.3）。 3.10 猪轮状病毒阳性样品及阴性样品（见附录B）。 4仪器设备 4.1 高速冷冻离心机 1 GB/T 34756—2017 4.2 2PCR扩增仪。 4.3 核酸电泳系统。 4.4恒温水浴锅。 4.5冰箱(2℃~8℃、-20℃)。 4.6凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 4.7 组织匀浆器或研钵。 4.8 3二级生物安全柜。 4.9 微量加样器（0.5μL~10μL;2μL~20μL；20μL~200μL;100μL~1000μL）。 5操作程序 5.1样品的采集、运输和处理 5.1.1样品采集和运输 采集腹泻急性期的小肠（5.0cm～10.0cm）或新鲜粪便（5.0g～10.0g），放到密封袋中，置于带有冰 袋的保存箱中，送至实验室。样品被运到实验室时，附带的冰袋应未完全融化；如样品不能被及时送到 实验室，应置于一20℃冰箱中保存，贮存要求不超过1个月；如需长期保存样品，应置于一80℃冰箱。 5.1.2样品处理 5.1.2.1小肠样品 取5.0cm～10.0cm小肠组织，用剪刀剪碎，加人10mLPBS，用适宜规格的组织研磨器或研钵研磨 后转移到适宜玻璃瓶中，每毫升样品加入RNA酶抑制剂RRI（40U/L）500uL，一20℃反复冻融3次 5.1.2.2粪便样品 取0.5g~1.0g新鲜粪便，加人到含5.0mL~10.0mL样品处理液（配方见A.2）的玻璃瓶中，每毫 升样品加人RNA酶抑制剂RRI（40U/μL)500uL，一20℃反复冻融3次后，摇匀，取1.0mL到1.5mL 离心管中，经12000r/min离心5min，取500μL上清液备用。 5.1.2.3细胞培养物样品 2000r/min离心10min，取1mL上清备用。 5.2RNA的提取 可选择市售商品化试剂盒、全自动核酸提取法或其他商品化提取法提取RNA。在提取RNA过程 中设立阳性和阴性对照样品，RNA提取操作应在生物安全柜内进行。 5.3反转录 5.3.1反转录引物序列 反转录引物采用下游引物P2，见附录C。 5.3.2反转录反应体系 反转录的反应体系见附录D。 2