ICS 65.020.01 B 16 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 24829—2009 毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法 Identification of Trichodorus species as virus vectors for import and export quarantine 2009-12-15发布 2010-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 24829—2009 目 次 前言 1 范围 规范性引用文件 2 鉴定依据 仪器和用具 试剂 6 现场检疫 7 实验室检验 形态学鉴定 8 9结果判断 10样品保存， 附录A（资料性附录） 毛刺线虫传毒种类基本信息表 附录B（资料性附录） 线虫分离方法 附录C（资料性附录） 线虫玻片标本制作方法 附录D（资料性附录） 4种传毒毛刺属线虫测计值表 附录E（资料性附录） 毛刺属种类鉴定多歧检索表（雄虫） 附录F（资料性附录） 毛刺属种类鉴定多歧检索表（雌虫） 13 附录G（资料性附录） 多歧检索表应用参考图· 17 附录H（资料性附录） 4种传毒种形态图 22 参考文献 26 GB/T24829—2009 前言 本标准的附录A、附录 B、附录 C、附录D、附录E、附录F、附录 G和附录H均为资料性附录 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心、广东出入境检验检疫 局，云南出人境检验检疫局、浙江大学。 本标准主要起草人：顾建锋、赵立荣、陈先锋、郑炜、李成清、杜宇。 GB/T24829—2009 毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了毛刺线虫属传毒种类的检疫鉴定方法。 本标准适用于植物、介质及土壤中毛刺线虫属传毒种类的检疫和鉴定 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是标注日期的引用文件，其随后所 有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不标注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 SN/T1158进出境植物盆景检疫规程 3鉴定依据 中文名：毛刺线虫属。 英文名：stubbyrootnematode。 毛刺线虫属（TrichodorusCobb，1913）隶属于线虫门［Nematoda（Rudolphi，1808）Lankester， 1877]，无侧尾腺纲（AdenophoreaLinstow，1905），三矛目（TriplonchidaCobb，1922），膜皮亚目（Diph- therophorinaCoomans&Loof,1970)，毛刺总科[Trichodoridea（Thorne,1935）Siddiqi,1974]，毛刺科 ［Trichodoridae（Thorne,1935）Siddiqi,1974]，毛刺亚科（TrichodorinaeThorne,1935）。 毛刺线虫属至今已发现56种，为多年生草本或木本植物的根部迁徒性外寄生线虫。不但直接取食 植物根系造成植物根系粗短、肿大、侧根增多，并引起寄主营养不良、生长失调等危害，更严重的是已知 其中有4种能传播烟草脆裂病毒（tobaccorattlevirus，TRV）和豌豆早褐病毒（peaearly-browningvi- rus，PEBV）等病毒（参见附录A）。它们分别是圆筒毛刺线虫（TrichodoruscylindricusHooper，1962）、 原始毛刺线虫［Trichodorusprimitiuus（deMan，1880）Micoletzky，1922]、相似毛刺线虫（Trichodorus similisSeinhorst,1963）和具毒毛刺线虫（TrichodorusviruliferusHooper，1963）。 范围和地理分布等信息可供参考（参见附录A）。 4仪器和用具 4.1仪器 生物显微镜（50倍～1000倍）、体视显微镜（10倍以上，具透射光源）、电热恒温培养箱、移液器 （20μL～200uL）、离心机（2000r/min以上）。 4.2用具 钟面皿或培养皿、盖玻片、载玻片、剪刀、挑针、酒精灯、线虫滤纸或纱布、500μL塑料管、细胞培养 皿、密闭塑料盒、漏斗、漏斗架、乳胶管、止水夹、加热板、分样筛（500目）。 5试剂 4%甲醛、甘油、指甲油、石蜡、溶液I（96%乙醇：甘油：蒸馏水20：1：79）、溶液Ⅱ（甘油：96% 乙醇=1：19)。 1 GB/T24829—2009 6现场检疫 注意观察苗木的生长状况、根部为害状，以及是否带介质、土壤等。重点选取有生长不良或粗短根 等症状的苗木及根际介质或土壤，如无可疑症状则按要求随机取样。取样后立即置密封塑料袋，标记后 及时送实验室检测。 具体抽样比例按SN/T1157和SN/T1158执行。 7实验室检验 7.1线虫分离 线虫分离方法参见附录B。 7.2体视显微镜镜检 毛刺属线虫多数体长500um～1000um，放大10倍以上可见。虫体呈圆柱形，短胖，行动缓慢 7.3标本制作 若发现可疑毛刺属线虫，需制作临时玻片或永久玻片（参见附录C）。 7.4生物显微镜观察、摄影和测量 应针对雌、雄虫主要鉴定特征仔细观察并显微摄影，重点包括整体形态、齿针、雌虫阴道骨化结构及 侧体孔、雄虫交合刺及泄殖腔前附着器等，并在每张图片上加相应标尺。 需观察、测量获得多岐检索表中各鉴定特征数字代码（参见附录D、附录E、附录F、附录G)，并计算 a、b、V等值。样品足够时，应观察和拍摄雌、雄虫各15条以上。 8形态学鉴定 8.1毛刺属形态鉴定特征 雄虫：热杀死后虫体尾部显著腹弯，呈“J”形，表皮不强烈膨胀，后食道腺通常不覆盖肠（但有时背面 或腹面覆盖肠）。通常有1个～3个腹中颈乳突，偶尔缺或有4个，一般于齿针基部和神经环之间具 1对侧颈孔。精子大，具呈香肠形或圆形的大精核。交合刺腹弯，光滑或具有纹饰、刚毛或缘膜。交合刺 悬肌形成显著的悬肌囊包围交合刺，无交合伞（除T.paracedarus和T.cylindricus外）。通常有3个 交合刺基端数倍体宽处。 雌虫：热杀死后略向腹面弯曲，双生殖腺对伸，有受精囊（除T.nanjingensis外）。阴道约占半个体 宽，阴道收缩肌发达，骨化结构显著。阴门孔状或横裂，很少纵裂。通常有1对～4对侧体孔，其中1对 侧体孔位于阴门附近一个体宽内，并且通常位于阴门后。肛门位于近末端，尾短圆，有1对尾孔。 雌虫阴道骨化结构的形状以及雄虫交合刺的形状是最重要的种类鉴定依据，其他主要鉴定特征还 有齿针长度、交合刺长度、泄殖腔前附着器、腹中颈乳突、交合刺的纹饰、雌虫侧体孔、引带等。 8.2传毒种类形态鉴定特征 传毒种类形态鉴定特征参见附录H。 8.2.1圆筒毛刺线虫（T.cylindricusHooper，1962） 雄虫：热杀死后虫体后部较直。排泄孔前有3个腹中颈乳突，第1个腹中颈乳突位于齿针区域内， 在齿针基部稍后有1对侧颈孔。具3个泄殖腔前附着器，最后一个位于缩回交合刺区域内。交合刺通 常具光滑的柄状体，杆部前具横纹和刚毛，杆部后膨大且光滑，具较小的交合伞。 雌虫：热杀死时虫体向腹面微弯曲，食道与肠从腹面略重叠，其他前部特征与雄虫相同。阴道为桶 状，阴门骨化结构发育良好，侧面观为圆三角形，且三角形尖端指向阴门。阴门腹面观为一短横裂，有 1对阴门后体孔。 与近似种比较：圆筒毛刺线虫雄虫与T.cottieri、T.obscurus相似，三者交合刺的杆后部膨大，且最 2