ICS 65.020.20 B 05 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T29375—2012 马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 Code of practice for in-vitro virus free seed potatoes plantlets breeding 2012-12-31发布 2013-06-20实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T293752012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国蔬菜标准化技术委员会（SAC/TC467）归口。 本标准起草单位：内蒙古大学内蒙古马铃薯工程技术研究中心、中国标准化研究院、甘肃爱兰马铃 薯种业有限责任公司、定西马铃薯研究所、重庆市薯类脱毒种苗快繁中心、秘国际马铃薯中心北京联 络处、四川省凉山州良圆马铃薯种业有限责任公司、内蒙古希森马铃薯种业有限公司、成都科欣农业生 物工程有限责任公司、北京辛普劳食品加工有限公司、湖南农业大学园艺学院、东北农业大学农学院、华 南农业大学园艺学院、云南省宣威市马铃薯种薯研发中心、福建省农业科学院作物研究所、河北省郑州 市蔬菜研究所、云南省丽江市农业科学研究所、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、内蒙古铃 田生物技术有限公司， 本标准主要起草人：张若芳、杨丽、周爱兰、孙清华、吴蕾、杜密茹、巩秀峰、王义、宋荣庆、李进福、 黄振霖、谢开云、严欣、王官茂、陈涛、曲仁山、熊兴耀、王凤义、曹先维、展康、汤浩、吴焕章、王绍林、罗其友、 李文刚。 I GB/T293752012 马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 1范围 本标准规定了马铃薯茎尖脱毒与组织培养、脱毒试管苗扩繁的技术要求和操作规程。 本标准适用于马铃薯脱毒试管苗的培育、扩繁。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB18133一2000马铃薯脱毒种薯 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 叶原基 leafprimordium 在茎尖生长点的基部形成的突起。 3. 2 stemtip 茎尖 芽顶端部分（0.1mm~10mm）其中包括分生组织（0.05mm~0.1mm）及芽原基和正在发育的叶 原基。 3.3 茎尖分生组织 meristem 茎部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群。 3. 4 离体培养 in-vitro propagation 从植物体分离出符合需要的器官、组织、细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行 培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 3.5 脱毒苗 in-vitrovirus freeplantlet 毒（PLRV)、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的试 管苗。 3.6 核心苗coreplantlet 通过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒，经试种观察具有原品种典型性状的脱毒苗。 3.7 基础苗basic plantlet 由核心苗繁殖的、经检测无病毒的脱毒苗。 1 GB/T293752012 4试管苗生产车间 4.1布局原则 脱毒苗生产车间布局应遵循方便消毒、减少污染的原则，遵守操作流程。周围应无污染源，与大田 生产隔离。要具备更衣室、清洗室、配制室、灭菌室、无菌贮存室、接种室、培养室等，各房间应隔离。生 产环境应清洁、干燥，具有可提供充足自然和人工光源的组培室、车间或生产线。 4. 2 布局平面示意图 接种室 姓存室 灰茵室 更衣室 培 室 室 推拉门 推 拉门 入口 图1试管苗生产车间布局平面示意图 4.3设备、试剂 试管苗生产的组培设备、试剂参见附录A。 4.4卫生要求 4.4.1接种室、培养室应保持卫生，定期消毒，每周至少消毒一次。按照40%的甲醛和高锰酸钾2：1 的比例，40%的甲醛溶液10mL倒人5g高锰酸钾容器内（每立方米空间用量），进行熏蒸。密闭1d 后，通风。 4.4.2接种前接种室应强制过滤通风。 4.4.3每次使用超净工作台前，应提前20min打开紫外灯。接种时关闭紫外灯打开风机，超净工作台 面及内壁用75%乙醇擦消毒。 4.4.4操作使用的所有工具，使用前应灭菌。操作过程中镊子、剪刀、解剖刀等工具，每次使用前接触 植物材料的部分应灼烧消毒或插人高温灭菌器中灭菌，冷却后使用，避免交叉污染。 清擦。 4.4.6若将温室作为培养室，在温室配备有降温水帘和风机，水帘外进风方向应加孔径0.247mm （60目）网纱。温室内门口有缓冲间，在缓冲间应有消毒装置，可放入生石灰或其他消毒剂，工作人员进 入时鞋底消毒。 4.4.7发现污染及时清除。 2 GB/T29375—2012 5茎尖脱毒与培养 5.1脱毒材料的选取 5.1.1田间选择 5.1.1.1在土壤肥力中等的地块，于现蕾期至开花期选择生长势强、具备原品种典型性状的健康植株， 做好标记。 5.1.1.2生育后期到收获期，在已做标记的植株中进行薯块复选。选择无病斑、虫蛀、机械损伤而且皮 色、肉色、薯形、芽眼等性状符合品种特征的幼龄薯，清洗泥土后催芽作为脱毒材料；或选取健康且具备 品种典型性状植株的中、下部短枝茎尖或腋芽进行茎尖剥离。 5.1.2病毒检测筛选 入选的块茎或植株，按照GB18133一2000中附录B的方法检测类病毒（PSTVd）；按照GB18133- 2000中附录A的方法检测病毒。筛选无类病毒（PSTVd)的块茎或植株作为茎尖脱毒基础材料；若检 测到没有带病毒的块茎或植株，可直接剥较大的茎尖。其后可不经试种观察直接进行扩繁培养。 5.1.3催芽处理和病毒钝化 打破休眠催芽。 5.1.3.2自然出芽的情况下，块茎长出2cm～3cm的新芽。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于 37℃±1℃培养箱中处理3周～4周，钝化病毒。 5.1.3.3人工打破休眠催芽的情况下，可采用0.1%多菌灵溶液浸泡30min或75%乙醇喷湿进行表 茎长出2cm~3cm的新芽。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于37℃士1℃培养箱中处理3周～ 4周，钝化病毒。 5.2茎尖培养 5.2.1茎尖培养基的制备 5.2.1.1茎尖培养基配方参见附录B。 5.2.1.2将制备好的茎尖培养基快速分装于容器中，用封口膜封口。 5.2.1.3将盛有培养基的容器整齐排列于灭菌锅内，1.1kg/cm、121℃高压灭菌20min，冷却后在无 菌贮存室放置3d5d，无污染的培养基放到超净工作台备用。 5.2.2材料消毒 取经催芽处理和病毒钝化处理的块茎的顶芽、2cm～3cm的侧芽，剪去外叶，用自来水冲洗30min 或0.1%的氯化汞溶液浸泡5min～10min，然后用无菌水冲洗4次～5次。 5.2.3茎尖剥离与接种 接种在超净工作台上操作。剥去外叶，借助40×双目解部镜，剥离茎尖直至露出半圆形光滑生长 点，用解刀或解部针从0.1mm~0.3mm处切，带1个~2个叶原基。迅速接种于盛有茎尖培养基 的容器中，进行离体培养。用酒精灯烤干容器口并封口，在容器上注明编号、品种名称、接种时间。 3