ICS 65.150 B 50 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T32757—2016 贝类染色体组型分析 Molluscs karyotype analysis 2016-06-14发布 2017-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T32757—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、威海市环翠区海洋与渔业研究所、山东省 海水养殖研究所。 本标准主要起草人：张岩、张辉、刘琪、张豫、潘婷、马爽、原永党 I GB/T 32757—2016 贝类染色体组型分析 1范围 本标准给出了贝类染色体组型分析的方法原理、仪器和设备、玻片标本的制备和组型分析方法。 本标准适用于贝类染色体组型分析。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18654.12养殖鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析 3术语和定义 GB/T18654.12界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 胚胎法earlyembryomethod 利用贝类胚胎为材料分析其染色体组型的方法。 3.2 担轮幼虫法 trochophoramethod 利用贝类担轮幼虫为材料分析其染色体组型的方法。 3.3 成体鳃组织法 gill tissuemethod 利用贝类成体鳃组织为材料分析其染色体组型的方法。 3.4 异形染色体 heteromorphicchromosomes 形态不同的一对同源染色体。 3.5 次缢痕 secondary constriction 染色体上部分DNA松懈形成核仁组织区的缢缩部位。 3.6 随体 satellite,trabant 通过次继痕与染色体主要部分相连，位于染色体末端的、圆形或圆柱形的染色体片段。 4原理 利用PHA等增加细胞分裂相、秋水仙素破坏细胞中的纺锤丝，采用怒同方法制备染色体玻片标 本，获得数目完整、形态清晰的染色体图像，用于染色体组型分析。 1 GB/T32757—2016 5药品和试剂 5.1 氯化钾(KCI)：分析纯。 5.2 甲醇(CHOH)：分析纯。 5.3 冰乙酸（C,HO,）：分析纯。 5.4 二甲苯[CH（CH），]：分析纯 中性树胶。 5.5 5.6 秋水仙素溶液：注射液用生理盐水配制，处理液用蒸馏水或海水配制，4℃避光保存。 0.075mol/L氯化钾溶液：称取5.59g氯化钾，定容至1000mL。 5.8 25%海水：取洁净的过滤海水，用蒸馏水稀释至25%。 5.9 植物血球凝集素（PHA）溶液：用生理盐水稀释至适宜的浓度。 5.10卡诺氏（Carnoys）固定液：3份甲醇加人1份冰乙酸（体积比），现用现配。 5.11磷酸缓冲液（PBS)：浓度为0.2mol/L，pH值为7.2,量取0.2mol/L的磷酸氢二钠（NaHPO,） 72mL和0.2mol/L的磷酸二氢钠（NaH,PO）28mL，混合均匀。 5.12吉姆萨（Giemsa）染液：称取0.5gGiemsa粉、甘油33mL，在研钵内用少量甘油与Giemsa粉混 合，研磨至无颗粒时，再加入剩余的甘油，56℃条件下保温2h后，加人33mL甲醇，过滤保存于棕色瓶 内，使用前用PBS稀释10倍。 5.132%醋酸洋红：先将100mL45%乙酸水溶液置入200mL的锥形瓶中煮沸，停止加热，然后慢慢 地分多次加入2g洋红粉末（切记不可一次倒入）。待全部倒入后，再煮沸1min～2min，并悬人一生锈 的小铁钉于染液中，过1min后取出，静置12h后过滤于棕色瓶中置于避光处备用。 5.14卡宝品红（Carbolfuchsin）改良液： A液：3g碱性品红溶于100mL70%乙醇，可长期保存； B液：10mLA液加入90mL5%苯酚水溶液，限14d内使用； 染色母液：B液45mL，37%甲醛6mL，冰乙酸6mL； 卡宝品红改良液：染色母液10mL，45%乙酸90mL，山梨醇1g，放置2周后使用。 5.15醋酸地衣红：取100mL45%的乙酸煮沸，慢慢加入地衣红至饱和，冷却后过滤 5.16醋酸铁苏木精水合氯醛染色液： A液：2g苏木精溶解在100mL45%冰乙酸中： B液：0.5g铁铵明矾[FeNH,（SO）212H2O]溶解在100mL45%冰乙酸中。 染色液：使用前一天将A液和B液等体积混合，每5mL中溶人2g水和氯醛[CClCH(OH)，]，配 制后在2d～14d内使用。 6仪器和设备 6.1 天平：感量0.1mg。 6.2 解剖工具。 试管：10mL具塞刻度试管。 6.4 表面血或培养血。 6.5 注射器及针头。 6.6 可调移液器及枪头。 6.7 显微镜（带显微摄影)。 游标卡尺：精度0.01mm。 6.8 2 GB/T32757—2016 6.9离心机:3000×g~6000×g。 7染色体标本的制备 7.1实验材料的选择 按不同方法选择胚胎、担轮幼虫或鳃组织。 7.2预处理 7.2.1胚胎法 将胚胎放入含秋水仙素的水中处理，秋水仙素浓度和处理时间因种类而不同，一般秋水仙素浓度 10mg/L~50mg/L，处理时间20min~40min。 7.2.2担轮幼虫法 将担轮幼虫放入含秋水仙素的水中处理，秋水仙素浓度和处理时间因种类而不同，一般秋水仙素浓 度10mg/L~100mg/L，处理时间1h~2.5h。 7.2.3成体鳃组织法 剪取部分鳃组织放入含秋水仙素的水中处理，秋水仙素浓度100mg/L～400mg/L，处理时间 30 min~2 h。 7.2.4整贝 7.2.4.1 秋水仙素预处理 可分为以下两种方法： 秋水仙素肌肉注射后暂养一段时间，注射剂量为2μg/g体重～8μg/g体重，暂养时间3h～ 15 h; b）对个体较小、不便于注射的贝类，可放置在含有秋水仙素浓度为0.1g/L～1g/L的水中暂养 4 h~12 h。 7.2.4.2 PHA+秋水仙素预处理 可分为以下两种方法： 按5μg/g体重~8μg/g体重肌肉注射PHA，暂养16h~24h后，按2μg/g~8μg/g体重注 射秋水仙素，暂养3h～6h；还可以在第一次注射PHA后18h～20h，同剂量重复注射1次， 暂养5h~6h后再注射秋水仙素。 b) 先将贝放人添加100μg/mLPHA的水中暂养16h～24h，再放人含50μg/mL秋水仙素的水 中暂养 4 h～6 h。 7.3低渗 可以采用以下方法之一进行低渗处理： a) 75mol/L的KCl低渗，处理时间因种类不同，从10min～2h不等； b）用25%海水低渗，处理时间30min～50min。 低渗前可采用胰蛋白酶消化、剪碎等方法提高低渗效果。