ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28981—2012 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of odontoglossum ringspot virus 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28981—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：闻伟刚、陈先锋、杨翠云、郭立新、鲁洁、张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧丽。 I GB/T28981—2012 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了齿兰环斑病毒血清学和分子生物学特征的检测方法。 本标准适用于种子、种球、花卉和种苗等植物材料中齿兰环斑病毒的检测，也适用于蚜虫等传播媒 介中该病毒的检测。 齿兰环斑病毒基本信息 2 中文名：齿兰环斑病毒 学名：odontoglossum ringspot virus 缩写：ORSV 属烟草花叶病毒属（Tobamouirus），齿兰环斑病毒其他信息参见附录A。 3方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（Doubleantibodysandwichenzyme-linked immunosorbentassay，DAS-ELISA）、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应（Reverse transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）、实时荧光反转录聚合酶链式反应（real-time fluorescentRT-PCR）进行检测鉴定。 4仪器设备、用具和试剂 4.11 仪器设备 PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（感量：0.001g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、 高速冷冻离心机、超低温冰箱（一80℃）、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉、酶标仪 4.2用具 可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等。 4.3试剂 主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。 5检测 5.1样品制备 取0.5g～10g种子、种球鳞片或畸形、变色症状的叶片等植物组织，在研钵或小型食品加工机中 1 GB/T 28981—2012 充分研磨，取五分之一量的均匀后样品，转人离心管中，按1：10（质量：体积）加人样品提取缓冲液振 荡混匀。媒介昆虫按1：10（质量：体积）加人样品提取缓冲液研磨混匀。2000g离心10min，上清液 即为DAS-ELISA、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测粗提液。 注：提取液在3h内使用，否则保存在4℃条件下。 5.2检测方法 5.2.1双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA） DAS-ELISA检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染ORSV的植物组织作阳性对 照，用样品提取缓冲液作空白对照。其中，阴性对照材料应该尽量与所检测样品一致 具体操作步骤见附录B。当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作 5.2.2RT-PCR方法 RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染ORSV的植物组织作阳性对照， 用ddH2O作空白对照。 具体操作步骤见附录C。当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作。 5.2.3实时荧光RT-PCR方法 实时RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染ORSV的植物组织作阳性 对照，用ddHO作空白对照。 具体操作步骤见附录D。当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作。 6结果判定 样品经DAS-ELISA与RT-PCR检测，结果均呈阳性，可判定样品携带齿兰环斑病毒。 7样品保存与记录 7.1样品保存 经检测确定携带齿兰环斑病毒的样品保存在一80℃冰箱中，并做好登记和标记工作。样品保存期 限至少1年。 7.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、名称、唯一性标识、检测时间、地点、方法和结果等。血清学测定 需有酶联反应吸光值的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR需要有荧光曲线图 与Ct值。结果记录与资料保存期限至少1年。 GB/T 28981—2012 附录A （资料性附录） 齿兰环斑病毒相关资料 A.1名称 中文名：齿兰环斑病毒 学名:odontoglossum ringspot virus 缩写：ORSV 分类地位：烟草花叶病毒属（Tobamouirus）。 A,2 2寄主范围 主要寄主是建兰（Cymbidiumensifolium）、蝴蝶兰（Phalaennopsissp.）、文心兰（Oncidiumsp.）等 兰科（Orchidaceae)植物。 A,3为害症状 感染了ORSV的兰花，叶片常产生黄化条纹或不规则褪绿色斑块，花部甚至出现畸形或褪色斑，红 色系花朵尤为明显。 A.4分布地区 在世界各地均有分布。 A. 5 5传播方式 可通过无性繁殖材料、机械操作携带汁液、蚜虫等传播。 A,6 粒体形态 长约300nm，宽约18nm的杆状病毒，颗粒中轴可清楚分辨，部分病毒头尾相连。 A.7 7基因组 ORSV粒体分散在细胞质内基晶格排列。内含体为X一体，病毒基因组6395nt。沉降系数 211.6S，核酸为单链RNA，相对分子质量2X10°。 3