ICS 65.020.30 B 43 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2695—2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 Code of practice for molecular detecting for genetic defects in cattle 行业标准信息服务平台 2015-02-09发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部 3发布 NY/T2695—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。 本标准起草单位：全国畜牧总站，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：刘丑生、刘刚、朱化彬、韩旭、王皓、冯海永、赵俊金、孟飞、邱小田。 行业标准信息服务平台 I NY/T 2695--2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 1范围 本标准规定了牛遗传缺陷基因的检测方法和结果判定。 本标准适用于奶牛和肉牛白细胞黏附缺陷症、瓜氨酸血症、牛尿苷酸合酶缺乏症、牛脊椎畸形综合 征、牛凝血因子XI缺乏症、牛并趾征、牛蜘蛛腿综合征基因的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T25887奶牛脊椎畸形综合征检测PCR-RFLP法 GB/T27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范 NY/T1670-—2008猪雌激素受体和卵泡刺激素β亚基单倍体型检测技术规程 SN/T1119进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法 SN/T2497.15进出口危险化学品安全试验方法第15部分：PCR-SSCP实验 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 遗传缺陷geneticdefects 家畜生殖细胞或受精卵中的遗传物质在结构或功能上发生了改变，从而使发育个体表现缺陷，具有 垂直遗传和终生性特征。 3. 2 单基因遗传缺陷monogenicgeneticdefects 单个基因变异而引起的遗传缺陷，其遗传方式符合孟德尔遗传定律。 3. 3 牛白细胞黏附缺陷症bovine leukocyteadhesion dericiency，BLAD 由嗜中性粒细胞表面糖蛋白细胞黏附分子整合素的β2亚单位基因CD18（β-2integrin subunit， alsocalledCD18)第2外显子第55位碱基发生(A→G)突变引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床 症状为重复性感染，鼻镜肿胀，颌下淋巴结肿大，常发生口腔、舌和肠道黏膜溃疡，并导致早期死亡。 3. 4 瓜氨酸血症citrullinemia，CN 由精氨酸琥珀酸合酶基因ASS（argininosuccinatesynthase）的第5外显子第256位碱基发生（C→ T)突变引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为特牛第1d～第2d出现精神沉郁、步态紊乱、 惊厥、失明等。 3.5 牛脊椎畸形综合征complexvertebralmalformation，CVM 由编码UDP-N-乙酰葡糖胺载体的基因SLC35A3（solutecarrierfamily35memberA3）的第4外 1 NY/T2695—2015 显子第73位碱基突变（G→T)引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状表现为胚胎或胎儿死亡， 或特牛脊椎弯曲畸形、肋骨畸形、心脏畸形、颈短、两前腿筋腱缩短等。 3. 6 牛尿苷酸合酶缺乏症deficiencyofuridinemonophophatesynthase，DUMPS 由尿苷酸合酶基因UMPS（uridinemonophophatesynthase）的C-末端405处的密码子存在一个点 突变导致密码子CGA转变为终止子TGA引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为胚胎或胎 儿期死亡，死亡率达100%。 3. 7 牛凝血因子X缺乏症factorXdeficiency，FX 由凝血因子XI基因FXI（factorXI）外显子12上插人了一个大小为76bp的DNA片段引起的一种 牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为FX携带者一般不表现症状，部分携带者和纯合个体表现为凝血 系乱、造成续牛成活率降低和繁殖性能下降以及免疫力降低。 3. 8 牛并趾征syndactyly 牛骤蹄症mulefoot，MF 由低密度脂蛋白受体结合蛋白基因LPR4（lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein4）第33 外显子发生了两个碱基的突变（C4863A，G4864T)引起一种牛遗传缺陷。其典型临床症状为在不同品 种中杂合个体表现不同的外显率，缺陷个体一般一只或多只蹄子均可表现骤蹄。牛骤蹄症个体行走不 稳，生产性能下降。 3.9 牛蜘蛛腿综合征spiderleg of arachnomelia and arthrogryposis，syndrome of arachnomelia and ar- throgryposis, SAA; arachnomelia syndrome,As 在瑞士褐牛中由SOUX（sulfiteOxidase）基因第4外显子第363位插人一个碱基（c.363-364insG） 而引起，在西门塔尔牛中由MOCS1（molybdenumcofactorsynthesisstep1）基因位于第11外显子第 1224～1225位CA两个碱基的缺失而引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为在瑞士褐牛和 西门塔尔牛中出现，AS个体表现为特牛先天性骨骼畸形、体重较轻，造成死胎或出生后不久死亡。 3.10 系谱pedigree 在调查某种遗传病畜禽各个个体的发病情况后，采用特定的符号和格式绘制成反映该群体各个个 体相互关系和发病情况的图解。 4原理 4.1牛白细胞黏附缺陷症的检测 利用CD18基因的DNA序列特异性引物,扩增CD18基因片段，采用PCR-SSCP或PCR-RFLP 方法确定个体基因型。 4.2瓜氨酸血症的检测 利用ASS基因的DNA序列特异性引物.扩增ASS基因片段，采用PCR-SSCP或PCR-RFLP方 法确定个体基因型。 4.3牛脊椎畸形综合征的检测 利用SLC35A3基因的DNA序列特异性引物，扩增SLC35A3基因片段，采用PCR-SSCP或错配 PCR突变分析确定个体基因型。 4.4牛尿苷酸合酶缺乏症的检测 2 NY/T2695—2015 利用尿苷酸合酶基因的DNA特异性引物，扩增尿苷酸合酶基因片段，采用PCR-RFLP方法确定 个体基因型。 4.5牛凝血因子XI缺乏症的检测 利用凝血因子XI缺乏症FXI基因特异性引物扩增，采用PCR检测确定个体基因型。 4.6牛并趾征的检测 利用LPR4基因DNA序列设计引物进行扩增，采用测序方法确定个体基因型。 4.7牛蜘蛛腿综合征的检测 利用SOUX基因或MOCS1基因DNA序列设计引物进行扩增，采用测序的方法确定个体基因型。 5仪器设备及试剂 5.1仪器设备 5.1.1离心机，离心力10000g。 5.1.2紫外可见分光光度计。 5.1.3移液器，量程0.1uL~1000μL。 5.1.4PCR仪，96孔热循环。 5.1.5水平电泳槽，长度31cm。 5.1.6凝胶成像系统。 5.2试剂 5.2.1AvaI内切酶。 5.2.2AvaⅡ内切酶。 5.2.3Eco47I内切酶。 5.2.4TaqI内切酶。 5.2.5TaqDNA聚合酶。 5.2.6乙醇（ethanol)，分析纯。 5.2.7 异丙醇（isopropanol），分析纯。 5.2.82 乙二胺四乙酸二钠（EDTA），分析纯 5.2.9 氯化钠(NaCI)，分析纯。 准信息服务 5. 2. 10 ）十二烷基硫酸钠（SDS），分析纯。 5.2.11乙酸，分析纯。 5. 2. 12 2溴化乙锭，分析纯。 5. 2. 13 3三(羟基甲基)氨基甲烷(TrisBase)，分析纯。 5.2.14琼脂糖（分析纯）。 5. 2. 15 Tris-HCI(pH 6. 8):将 12. 1 g Tris Base溶于 80 mL蒸馏水中用浓 HCI 将 pH调至 6. 8,将 体积调至100mL，高压除菌，室温储存。 5.2.16缓冲液： a) DNA溶解缓冲液(TE):取5mL1mol/L Tris-HCIBuffer(pH=8.0)和0.5mol/LEDTA (pH=8.0)加人400mL蒸馏水的烧杯中，将溶液定容到500mL后，高温高压灭菌，室温保存； 电泳解缓冲液50XTAE：称取242gTrisBase.37.2gNa2EDTA加人1L烧杯中，然后加人 b） 800mL去离子水，充分搅拌溶解，再加人57.1mL醋酸，充分混匀定容至1L，室温保存； c）10×上样缓冲液：用移液器吸取2mLEDTA（500mmol/L，pH8.0）加人约40mL蒸馏水中， 3 NY/T2695—2015 再称取250mg溴酚蓝，量取50mL丙三醇，定容至100mL，4℃保存。 5.2.171%~3%琼脂糖凝胶：称取1g~3g琼脂糖，加100mLTAE煮沸，等降至50℃~60℃时，加人 溴化乙锭或其他燃料。 5.2.182%~5%琼脂糖凝胶：称取2g~5g琼脂糖，加100mLTAE煮沸，等降至50℃~60℃时，加人 溴化乙锭或其他燃料。 6检测步骤 6.1样品制备 收集牛血液、组织（耳组织、肌肉、尾组织、皮肤等）、