(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211273600.6 (22)申请日 2022.10.18 (71)申请人 陕西省生物农业研究所 地址 710043 陕西省西安市新城区咸宁中 路125号陕西省科学院后楼生物农业 研究所 (72)发明人 常青　杨艺炜　刘晨　彭德良　 陈志杰　李英梅　 (74)专利代理 机构 西安铭泽知识产权代理事务 所(普通合伙) 61223 专利代理师 庄华红 (51)Int.Cl. C12M 1/12(2006.01) C12M 1/00(2006.01) (54)发明名称 一种腐烂 茎线虫虫卵的收集方法 (57)摘要 本发明属于植物保护技术领域， 具体涉及一 种腐烂茎线虫虫卵的收集方法， 包括以下步骤： 将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％ 蔗糖溶液混合， 离心， 所得上清液与沉淀分别过 滤， 收集滤液， 滤液合并后离心， 收集沉淀A； 将沉 淀A用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀， 缓 慢加入水， 离心， 收集水与蔗糖溶液分界处的虫 液， 加水稀释后再次离心， 收集沉淀B； 将沉淀B用 质量分数25～45％蔗糖 溶液分散， 加入水， 离心， 收集沉淀C， 加水稀释后再次离心， 收集沉淀D， 即 得腐烂茎线虫虫卵。 本发明提供的收集方法， 采 用蔗糖密度梯度离心， 能够有效将虫卵与幼虫、 成虫区分开来， 从混合虫态的腐烂茎线虫群体中 大量分离纯化得到虫卵。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115449463 A 2022.12.09 CN 115449463 A 1.一种腐烂 茎线虫虫卵的收集方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液混合， 离心， 所得上清液与沉 淀分别过 滤， 收集滤 液， 滤液合并后离心， 收集 沉淀A； 将所述沉淀A用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀， 缓慢加入水， 离心， 收集水与蔗 糖溶液分界处的虫 液， 加水稀释后再次离心， 收集 沉淀B； 将所述沉淀B用质量分数25～45％蔗糖溶液分散成混悬液， 加入水， 离心， 收集沉淀C， 加水稀释后再次离心， 收集 沉淀D， 即得腐烂 茎线虫虫卵。 2.根据权利要求1所述的快速分离方法， 其特征在于， 所述含有腐烂茎线虫的材料与质 量分数30～40％蔗糖溶 液的用量比为1g∶2 ～10mL。 3.根据权利要求2所述的快速分离方法， 其特征在于， 所述沉淀A与质量分数70～80％ 蔗糖溶液的体积比为1∶ 6～10 。 4.根据权利要求3所述的快速分离方法， 其特征在于， 所述沉淀B与质量分数25～45％ 蔗糖溶液的体积比为1∶2 ～10。 5.根据权利 要求4所述的收集方法， 其特征在于， 所述离心是在2000～4000rpm离心5～ 10min。 6.根据权利要求1所述的收集方法， 其特征在于， 所述过滤是过100目筛网， 并用水多次 冲洗筛网。 7.根据权利要求1所述的收集方法， 其特征在于， 所述加水稀释是将所述虫液或所述沉 淀C与水按体积比1∶ 5～10混合。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115449463 A 2一种腐烂茎线虫 虫卵的收集方 法 技术领域 [0001]本发明属于植物保护技 术领域， 具体涉及一种腐烂 茎线虫虫卵的收集方法。 背景技术 [0002]腐烂茎线虫(Ditylenchus  destructor)是危害马铃薯与甘薯等作物的重要植物 病原线虫， 其寄主范围广泛， 还可以危害豌豆、 当归、 薄荷、 三七、 花生、 啤酒花、 烟草、 向日 葵、 西洋参、 党参、 当归、 鸢尾、 郁金香等90～120种植物。 该线虫最初于1937年由日本传入我 国， 而我国对于腐烂茎线 虫的研究起步较晚， 有关我国腐烂茎线 虫的报道 最早见于1982年。 目前， 腐烂茎线 虫在我国黑龙江、 吉林、 辽宁、 内蒙古、 陕西、 甘肃、 宁夏、 新 疆、 北京、 河北、 河 南、 山东、 安徽、 江苏、 浙江、 福建、 湖北、 云南、 贵州等地普遍发生， 且有进一步暴发成灾趋 势。 当前急需对腐烂 茎线虫开展科 学防控技 术研究。 [0003]为了深入全面地研究腐烂茎线虫， 试验需要大量的虫源。 目前已经有相关研究建 立了利用马铃薯、 甘薯、 胡萝卜等作物的活体植物组织培养方法以及利用葡萄孢属 (Botryti s)、 镰孢菌属(Fusarium)、 链 格孢属(Alternaria)、 丝核菌属(Rhizoctonia)、 青霉 属(Penicillium)等约40个属70多种真菌的真菌培养方法。 但是由于腐烂茎线虫世代重叠 严重， 虫态很不整齐， 无论是活体植物组织培养还是真菌培养， 腐烂茎线虫都是成虫、 幼虫 和卵三者同时存在， 对于后续 开展深入研究造成了障碍 。 [0004]现有线虫分离收集方法主要为浅盘法与漏斗法， 或者二者的结合， 上述分离方式 都需要依赖虫体 自身的运动能力， 而虫卵本身并无运动能力， 因此现有腐烂茎线虫分离方 法无法有效收集到腐烂 茎线虫虫卵。 [0005]因此， 需要研究一种可 单独收集腐烂 茎线虫虫卵的方法。 发明内容 [0006]鉴于以上技术问题， 本发明首次建立了腐烂茎线虫虫卵的收集方法， 可以有效且 大量分离收集到腐烂茎线 虫虫卵， 为后续富集不同虫态虫体及开展各种虫态的特异 性研究 奠定了基础。 [0007]本发明提供一种腐烂 茎线虫虫卵的收集方法， 包括以下步骤： [0008]将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液混合， 离心， 所得上清液 与沉淀分别过 滤， 收集滤 液， 滤液合并后离心， 收集 沉淀A； [0009]将所述沉淀A用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀， 缓慢加入水， 离心， 收集水 与蔗糖溶 液分界处的虫 液， 加水稀释后再次离心， 收集 沉淀B； [0010]将所述沉淀B用质量分数25～45％蔗糖溶液分散成混悬液， 加入水， 离心， 收集沉 淀C， 加水稀释后再次离心， 收集 沉淀D， 即得腐烂 茎线虫虫卵。 [0011]优选地， 所述含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液的用量比为1g ∶2～10mL。 [0012]优选地， 所述 沉淀A与质量分数 70～80％蔗糖溶 液的体积比为1∶ 6～10 。说　明　书 1/5 页 3 CN 115449463 A 3