(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211243531.4 (22)申请日 2022.10.12 (71)申请人 广州市乾相生物科技有限公司 地址 510220 广东省广州市海珠区上冲南 约42号之四101 申请人 态创生物科技 （广州） 有限公司 (72)发明人 吴嵩　张志乾　陈西朋　罗元廷　 刘丽花　杨敏　江翱　王帆　 吴奕瑞　 (74)专利代理 机构 苏州根号专利代理事务所 (普通合伙) 32276 专利代理师 项丽 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/80(2006.01)C09K 11/06(2006.01) C12M 1/42(2006.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 1/02(2006.01) (54)发明名称 荧光-pH生物传感器及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种荧光 ‑pH生物传感器， 包 括： 由单体传感蛋白交联而成的多聚传感蛋白； pH响应荧光混合物， 所述荧光混合物共价交联到 多聚传感蛋白上。 还公开了其制备方法及应用。 本发明的荧光 ‑pH生物传感器具有pH传感灵敏、 传感范围广、 传感线性好和毒性低等优势， 适用 于在高通量筛选过程中产生pH变化的物质的检 测， 特别适用于 应用在微 流控高通 量筛选上。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115308186 A 2022.11.08 CN 115308186 A 1.一种荧 光‑pH生物传感器， 其特 征在于包括： 由单体传感蛋白交联而成的多聚传感蛋白； pH响应荧 光混合物， 所述 荧光混合物共价交联到多聚传感蛋白上。 2.根据权利要求1所述的荧光 ‑pH生物传感器， 其特征在于： 所述单体传感蛋白为牛血 清白蛋白、 人 血清白蛋白、 刀豆球蛋白、 络蛋白、 卵清蛋白、 牛球蛋白或粘蛋白。 3.根据权利要求2所述的荧光 ‑pH生物传感器， 其特征在于： 所述单体传感蛋白的交联 方法为重氮 化法、 戊二醛法、 甲醛法、 过碘酸盐氧化法、 混合酸 酐法、 碳二亚胺法、 活泼酯法、 二异氰酸酯法、 偶氮苯甲酸法、 O ‑羧甲酸羟胺法、 对肼基苯甲酸法、 多元酸酐法、 叠氮化法、 氯乙酸钠法、 亚胺酸酯法或卤代硝基苯法。 4.根据权利要求3所述的荧光 ‑pH生物传感器， 其特征在于： 所述pH响应荧光混合物从 7‑甲氧基‑3‑羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、 7 ‑甲氧基‑3‑羧基香豆素、 7 ‑甲氧基‑4‑羧基香豆 素、 7‑羟基‑3‑羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、 7 ‑羟基‑4‑甲基香豆素 ‑3‑乙酸、 7‑羟基‑4‑甲基香 豆素‑3‑乙酸琥珀酰亚胺酯、 4 ‑氨基香豆素、 异硫氰酸荧光素酯、 5 （6） ‑羧基二乙酸荧光素琥 珀酰亚胺酯、 5 （6） ‑羧基荧光素二乙酸酯、 5(6) ‑羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯、 罗丹明   B、 2‑(2′ ‑羟基苯基)苯并噻 唑中选择。 5.根据权利要求4所述的荧光 ‑pH生物传感器， 其特征在于： 所述pH响应荧光混合物为 7‑甲氧基‑3‑羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、 7 ‑甲氧基‑3‑羧基香豆素、 异硫氰酸荧光素酯、 5 （6）‑羧基二乙酸 荧光素琥珀酰 亚胺酯和2 ‑(2′ ‑羟基苯基)苯并噻 唑的混合物。 6.根据权利 要求1所述的荧光 ‑pH生物传感器， 其特征在于： 所述荧光 ‑pH生物传感器的 分子量在10 0KDa以上。 7.权利要求1 ‑6中任一项所述的荧 光‑pH生物传感器在微 流控细胞分选中的应用。 8.权利要求1 ‑6中任一项所述的荧光 ‑pH生物传感器在菌株或靶标的高通量筛选中的 应用， 所述菌株为产酸菌株或者产碱菌株、 耐酸或耐碱菌株， 所述靶标为CO2还原酶变体或 Bst聚合酶变 体。 9.权利要求1 ‑6中任一项所述的荧 光‑pH生物传感器的制备 方法， 其步骤包括： （1） 在单体传感蛋白中加入交联剂进行反应， 使单体传感蛋白交联成多聚传感蛋白； （2） 加入交联终止剂， 终止交联反应； （3） 将多聚传感蛋白与pH响应荧光混合物混合， 调节pH至7， 并通过调节各荧光剂的比 例至体系为无色， 进行反应； （4） 回收荧光 ‑pH生物传感器： 使用分子筛层 析法或超滤法， 回收分子量在100  kDa以上 的荧光‑pH生物传感器。 10.根据权利要求9所述的荧光 ‑pH生物传感器的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中单体传感蛋白的浓度为1 ‑30 g/L， 使用的交联剂为戊二醛或碳二亚胺， 交联剂使用浓度 为0.1‑5 mM， 交联时间为5 ‑60 min， 交联温度为 4‑30℃。 11.根据权利要求9所述的荧光 ‑pH生物传感器的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （2） 中的交联终止剂为甘氨 酸、 碳酸氢钠或者碳酸钠， 所述交联终止剂的使用浓度为0.1 ‑5 mM， 处理时间是5 ‑20 min， 处理温度是4 ‑30℃。 12.根据权利要求9所述的荧光 ‑pH生物传感器的制备方法， 其特征在于： 步骤 （3） 中pH 响应荧光混合物的添加浓度为0.0 5‑1 mM， 反应时间是0.5 ‑5 h， 反应温度是20 ‑37℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115308186 A 2荧光‑pH生物传感器及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种荧 光‑pH生物传感器及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]pH传感器一直是科研和商业化领域的重要研究对象。 传统pH传感器是基于拉曼光 谱的颜色传感器， 如酚红、 甲基橙、 孔雀石绿等， 这也是pH试纸测量pH的原理。 这类pH检测方 法可以通过直观的视觉颜色比对来确定pH的大致范围， 广泛应用于环境和溶液的pH检测 中。 但是， 基于拉曼光谱的颜色传感器在高通量筛选中数据处理的通量很低， 不仅需要额外 的图像识别和处理软件， 而且处理速率只有10  Hz/s左右。 而基于荧光的生物传感器处理速 率可达数千H z/s。 因此， 基于拉曼光谱的pH生物传感器难以应用于大通 量生物筛选平台上。 [0003]pH变化是许多催化反应的共同现象。 如产酸菌或者产碱菌在发酵过程中会发生明 显的pH迁移， 迁移 程度与产 物的产量呈明显的正比。 如甲酸脱 氢酶在固定二氧化碳的时候， 会产生甲酸的终产物， 最终导致反应体系pH 向酸性迁移。 如基因诊断过程中使用到的环介 导等温扩增技术 （LAMP） ， 在聚合酶延伸过程中不断产生焦磷酸， 过量积累的焦磷酸会导致 pH快速下降， 最终在基于拉曼光谱的颜色传感器中发生颜色的变化， 从而达到快速检测 基 因的目的。 因此， 基于pH变化的催化反应在 商业上具有重要的应用价值。 这类酶的高活性变 体的高通 量筛选也是行业内亟 待解决的问题。 [0004]为了解决基于拉曼光谱的颜色传感器在pH筛选中通量低、 数据处理困难等问题， 许多公司也在开发基于荧光的pH传感器， 如赛 默飞世尔公司的pHrodo ™ pH Sensor Dyes。 这类试剂可以进入到细胞内， 对不同亚细胞器内部的pH变化进行实时监控， 受到广泛的关 注。 但仍存在灵敏度低、 pH线性不明显、 检测范围窄、 特异性低、 细胞毒性大等问题。 因此难 以应用在 细胞高通 量筛选上。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种荧 光‑pH生物传感器， 可用于微 流控或者 流式分选 。 [0006]本发明的目的通过以下技 术方案实现： 一种荧光‑pH生物传感器， 包括： 由单体传感蛋白交联而成的多聚传感蛋白  ； pH响应荧 光混合物， 所述 荧光混合物共价交联到多聚传感蛋白上。 [0007]单体传感蛋白选用富含天冬氨酸、 谷氨酸、 赖氨酸和精氨酸的蛋白， 其中天冬酰胺 和谷氨酸的羧基支 链用于蛋白的交联， 赖氨酸和精 氨酸的氨基支 链用于标记荧 光物质。 [0008]优选的， 所述单体传感蛋白为牛血清白蛋白、 人血清白蛋白、 刀豆球蛋白、 络蛋白、 卵清蛋白、 牛球蛋白或粘蛋白  。 [0009]优选的， 所述单体传感蛋白的交联方法为重氮化法、 戊二醛法、 甲醛法、 过碘酸盐 氧化法、 混合酸酐法、 碳二亚胺法、 活泼酯法、 二异氰酸酯法、 偶氮苯甲酸法、 O ‑羧甲酸羟胺 法、 对肼基苯甲酸法、 多元酸酐法、 叠氮化法、 氯乙酸钠法、 亚胺酸酯法或卤代硝基苯法  。说　明　书 1/4 页 3 CN 115308186 A 3