(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210690415.0 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 中国热带农业科 学院三亚研究院 地址 572000 海南省三 亚市崖州区创意产 业标准厂房二期三楼 235区 (72)发明人 赵家桔　应东山　高玲　张如莲　 李莉萍　 (74)专利代理 机构 北京和信华成知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11390 专利代理师 申龙华 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/04(2006.01)C12M 1/34(2006.01) C12M 1/26(2006.01) C12M 1/12(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称 一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了第一步， 取西瓜汁： 通过在西 瓜田中随机挑选一些西瓜， 通过取汁装置将西瓜 去皮与去籽， 得到5 ‑10ml的西瓜汁； 第二步， 西瓜 汁预处理： 通过高速离心去掉西瓜汁上清， 留沉 淀样品， 以无菌操作将沉淀样品转入培养基中， 室温培养一段时间； 第三步， 提取培养后样品中 的DNA； 第四步， 利用PCR检测技术对上述DNA进行 处理， 以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。 本发 明通过取汁装置快速获得样品后即可进行检测， 而且可快速、 可靠地提取到用于PCR快速检测西 瓜果斑病菌技术所需的DNA， 可用于西瓜果斑病 菌的快速及时诊断， 对该病害的预防和及时防治 具有十分重要的意 义。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 115044687 A 2022.09.13 CN 115044687 A 1.一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 第一步， 取西瓜汁： 通过在西瓜田中随机挑选一些西瓜， 通过取汁装置将西瓜去皮与去 籽， 得到5‑10ml的西瓜汁； 第二步， 西瓜汁预处理： 通过高速离心去掉西瓜汁上清， 留沉淀样品， 以无菌操作将沉 淀样品转入培 养基中， 室温培 养一段时间； 第三步， 提取培 养后样品中的DNA； 第四步， 利用PCR检测技 术对上述DNA进行处 理， 以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌 。 2.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 第一步中， 挑选西瓜时， 选择西瓜刚成熟期进行检测。 3.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 第二步中， 培养基为2×YT培养基。 4.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 第二步中， 室温培养时间为6 ‑8小时。 5.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 第三步中， 提取培养后样品中的DNA具体为： S1,将2ml的沉淀样品中加入300ul裂解液， 30mM三羟甲基氨基甲烷 ‑醋酸， 10mM醋酸钠， 1mM乙二胺四乙酸， 1％十二 烷基磺酸钠， pH7.8， 混匀， 置 于37℃水浴1小时； S2,然后加入10 0ul5mol/L的氯化钠溶 液， 混匀后于13 000rpm离心15分钟； S3,取上清液， 用苯酚抽提2次， 氯仿抽提1次； S4,加两倍体积无水乙醇， 1/10体积醋酸钾3M， pH8.0， ‑20度保存1小时后， 13000rpm离 心15分钟， 弃上清液， 沉淀用70％乙醇洗2次； 置于室温干燥后， 溶于50ulTE溶液中， 置4℃保 存备用。 6.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 第三步中， 提取培养后样品中的DNA具体为： S1,将2ml的沉淀样品中加入400ul裂解液， 40mM三羟甲基氨基甲烷 ‑醋酸， 20mM醋酸钠， 1mM乙二胺四乙酸， 1％十二 烷基磺酸钠， pH7.8， 混匀， 置 于37℃水浴1小时； S2,然后加入20 0ul5mol/L的氯化钠溶 液， 混匀后于13 000rpm离心15分钟； S3,取上清液， 用苯酚抽提2次， 氯仿抽提1次； S4,加两倍体积无水乙醇， 1/10体积醋酸钾3M， pH8.0， ‑20度保存1小时后， 13000rpm离 心15分钟， 弃上清液， 沉淀用70％乙醇洗2次； 置于室温干燥后， 溶于50ulTE溶液中， 置4℃保 存备用。 7.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 第三步中， 提取培养后样品中的DNA具体为： S1,将2ml的沉淀样品中加入500ul裂解液， 50mM三羟甲基氨基甲烷 ‑醋酸， 30mM醋酸钠， 1mM乙二胺四乙酸， 1％十二 烷基磺酸钠， pH7.8， 混匀， 置 于37℃水浴1小时； S2,然后加入3 00ul5mol/L的氯化钠溶 液， 混匀后于13 000rpm离心15分钟； S3,取上清液， 用苯酚抽提2次， 氯仿抽提1次； S4,加两倍体积无水乙醇， 1/10体积醋酸钾3M， pH8.0， ‑20度保存1小时后， 13000rpm离 心15分钟， 弃上清液， 沉淀用70％乙醇洗2次； 置于室温干燥后， 溶于50ulTE溶液中， 置4℃保权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044687 A 2存备用。 8.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 所述取汁 装置包括底板(13)， 所述底板(13)的一端 固定连接有 固定板(16)， 所述固定板(16)的侧壁 上通过转动装置连接有转动板(4)， 所述转动板(4)的一侧固定连接有第一伸缩气缸(3)， 所 述转动板(4)的另一个固定连接有在第二伸缩气缸(5)， 所述第一伸缩气缸(3)的一端固定 连接有第一压板(2)， 所述第一压板(2)的侧壁上固定连接有多个凸块(1)， 所述第二伸缩气 缸(5)的一端固定连接有第二压板(6)， 所述第二压板(6)的侧壁上固定连接有多个切刀 (7)， 所述固定板(16)的侧壁上固定连接有第二连接杆(15)， 所述第二连接杆(15)的一端固 定连接有放置箱(8)， 所述放置箱(8)的底侧壁上开设有多个通孔(9)， 所述固定板(16)的侧 壁上固定连接有第一连接杆(14)， 所述第一连接杆(14)的一端固定连接有过滤箱(10)， 所 述过滤箱(10)的底侧设有过 滤网(11)， 所述底板(13)的上侧设有收集箱(12)。 9.根据权利要求8所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 所述转动 装置包括机箱(18)， 所述机箱(18)固定连接在固定板(16)的侧壁上， 所述机箱(18)的侧壁 上固定连接有伺服电机(17)， 所述伺服电机(17)的输出端固定连接有转动杆(19)， 所述转 动杆(19)贯 穿固定板(16)的侧壁， 所述 转动杆(19)的一端固定连接在转动板(4)的侧壁上。 10.根据权利要求8所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法， 其特征在于， 每个所述 凸块(1)呈半球形设置 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044687 A 3