(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210629575.4 (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 福建省长汀盼 盼食品有限公司 地址 366300 福建省龙岩市长汀县腾飞经 济开发区 (72)发明人 盖桂林　缪宜祥　黄登雄　 (74)专利代理 机构 厦门原创联合知识产权代理 有限公司 3 5293 专利代理师 魏思凡 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01)C12R 1/19(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称 一种食品微生物检测的探针、 芯片、 试剂盒 及方法 (57)摘要 本发明提供了针对常见焙烤食品微生物大 肠杆菌 (Escherichia  coli) 、 斯特菌 (Listeriamonocytogenes)、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus  aureus)、 蜡样芽胞杆菌 (Bacillus  cereus)、 创伤弧菌(vibrio   vulnificus) 、 副溶血性弧菌 (vibrio   parahaemolyticus)的检测引物和探针。 通过筛 选低同源性序列， 分别设计针对这六种食品微生 物的特异性引物和特异性探针， 采用多重PCR技 术， 实现对这六种食品微生物的快速有效检测。 本发明提供了一种简单、 样品需求量小， 快速、 灵 敏度高、 易于推广的多种食品微生物的检测方 法， 并且该试剂盒成本低、 适用范围广。 本发明还 利用液相芯片技术和扫描芯片技术， 建立了能特 异性检测上述六种食品微生物检测方法， 该检测 方法能够对目标基因进行快速检测， 其检测灵敏 度高， 特异性 好。 权利要求书1页 说明书7页 序列表8页 附图1页 CN 114934045 A 2022.08.23 CN 114934045 A 1.一种同时检测多种焙烤食 品微生物的引物和探针组合， 其特征在于所述引物探针组 合包括： 用于检测大肠杆菌(Escherichia  coli)的如SEQ  ID NO： 1‑2所示的特异性引物对， 如SEQ ID NO： 3所示的特异性探针； 用于检测斯特菌(Listeria  monocytogenes)的如SEQ   ID NO： 4‑5所示的特异性引物对， 如SEQ  ID NO： 6所示的特异性探针； 用于检测金黄色葡萄 球菌(Staphylococcus  aureus)的如SEQ  ID NO： 7‑8所示的特异性引物对， 如SEQ  ID NO： 9 所示的特异性探针； 用于检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus  cereus)的如SEQ  ID NO： 10‑11所示 的特异性引物对， 如SEQ  ID NO： 12所示的特异性探针； 用于检测创伤弧菌(vibrio   vulnificus)的如SEQ  ID NO： 13‑14所示的特异性引物对， 如SEQ  ID NO： 15所示的特异性探 针； 以及用于检测副溶血性弧菌(Vibrio  Parahemolyticus)的如SEQ  ID NO： 16‑17所示的 特异性引物对， 如SEQ  ID NO： 18所示的特异性探针。 2.根据权利要求1所述的一种同时检测多种焙烤食品微生物的引物和探针组合， 其特 征在于所述特异性探针的5 ’端修饰的活性有机基团为氨基或羟基。 3.根据权利要求1所述的一种同时检测多种焙烤食品微生物的引物和探针组合， 其特 征在于所述如序列表SEQ  ID NO： 1， 5， 7， 10， 13， 16上游特异性引物的5 ’端修饰为生物素标 记。 4.根据权利要求1所述的一种同时检测多种焙烤食品微生物的引物和探针组合， 其特 征在于所述所述特异性引物和探针的靶基因序列如序列表SEQ  ID NO： 19‑24所示。 5.一种同时检测多种焙烤食 品微生物的试剂 盒， 其特征在于所述试剂盒包括特异性引 物如SEQ ID NO.1‑2， 4‑5， 7‑8， 10‑11， 13‑14， 16‑17所示； 引物探针如序列表SEQ  ID NO： 3， 6， 9， 12， 15， 18。 6.一种芯片扫描的食品微生物检测方法， 包括： (1)芯片设计与制备， (2)细菌DNA特异 性PCR扩增 和杂交， (3)芯片杂交与扫描。 7.一种液相芯片检测微生物的方法， 包括： (1)微球探针的交联， (2)探针杂交， (3)液相 芯片检测。 8.一种食品微生物基因检测芯片， 采用交联引物探针如序列表SEQ  ID NO： 3， 6， 9， 12， 15， 18所示的平面扫描芯片。 9.一种食品微生物基因检测芯片， 采用交联引物探针如序列表SEQ  ID NO： 3， 6， 9， 12， 15， 18所示的微球探针芯片。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934045 A 2一种食品微生物检测的探针、 芯片、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于食品微生物检测和分子生物学领域， 具体涉及一种食品微生物大肠杆 菌(Escherichia  coli)、 斯特菌(Listeria  monocytogenes)、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus  aureus)、 蜡样芽胞杆菌(Bacillus  cereus)、 创伤弧菌(vibrio   vulnificus)、 副溶血性弧菌(vibrio  parahaemolyticus)的检测探针、 芯片、 试剂盒及方 法。 背景技术 [0002]微生物与人类 活动密切相关， 微生物技术广泛用于食品和药品生产、 新型材料、 能 源的开发及环境治理等方面。 但另一方面， 微生物污染也是引发食源性疾病的主要因素之 一， 而食品安全是直接 关系到人民群众生命、 健康和社会稳定的重大公共安全问题。 微生物 污染存在 食品生产、 加工、 储存、 运输、 销售到食用的整个过程的每个环节中。 食品微生物检 验是保证食品安全的技术手段， 微生物指标可真实反 映食品原料、 生产加工过程以及加工 环境是否得到有效控制， 也是判定食品能否安全 食用的科 学依据之一。 [0003]目前食品中微生物检测主要依据GB  4789系列标准， 采用平板计数的方法进行检 验。 对于非致病菌的检验， 按照此种检验方法， 耗时较长， 例如:菌落总数仅培养时间就需 48h， 霉菌及酵母菌检验至少则需要5d。 而对于致病菌的检测耗时则更长， 包括预增菌、 增 菌、 分离、 生化试验、 镜检以及血清学验证等一系列的检测程序， 一般需要5～7d。 此外， 传统 平板计数法对实验室条件(设备设施和环境)、 对人员专业技能和人员数量要求高。 繁琐的 检测程序不仅占用了大量的检测资源， 更重要的是冗长的检测周期既不利于生产者对食品 的即时监控和在线控制， 也不利于监管部门对问题食品的快速反应， 尤其是在一些短保质 期产品， 如部分乳制品、 糕点类制品和豆制品的微 生物控制方面， 其局限性日益显现。 [0004]焙烤食品是指以粮、 油、 糖、 蛋、 乳等为主料， 添加适量辅料， 并经调制、 成型、 焙烤 工序制成的食品， 常见的包括面包、 饼干、 糕 点等。 焙烤食品富含营养， 微生物污染后有 可能 大量增殖引发疾病。 焙烤食品引发的食物中毒事件的原因食物包括裱花蛋糕、 夹心蛋糕、 泡 芙面包等， 致病因子包括金黄色葡萄球菌、 蜡样芽胞杆菌、 沙门菌等。 目前对焙烤食品微生 物污染的专门检测试剂盒和检测方法较少， 为提高焙烤食品微生物检测精准度和速度特设 计本申请的。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种同时检测多种食品微生物的引物探针 组合、 试剂盒以及 方法， 从而解 决现有技术中缺乏能够快速有效同时检测大肠杆菌(Escherichia  coli)、 斯 特菌(Listeria monocytogenes)、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus  aureus)、 蜡样芽胞杆 菌(Bacillus  cereus)、 创伤弧菌(vibrio  vulnificus)、 副溶血性弧菌(vibrio   parahaemo lyticus)， 本发明采用如下技 术方案： [0006]1.一种同时检测多种焙烤食品微生物的引 物和探针组合， 该引物探针组合包括：说　明　书 1/7 页 3 CN 114934045 A 3