(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111356121.6 (22)申请日 2021.11.16 (71)申请人 上海市第十人民医院 地址 200072 上海市 静安区延长中路3 01号 (72)发明人 刘淑鹏　程忠平　刘琦　葛瑶　 (74)专利代理 机构 上海领誉知识产权代理有限 公司 31383 代理人 王琰 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种CAR ‑NK细胞及其制备方 法与应用， 所述CAR ‑NK细胞为在NK细胞表面表 达 靶向间皮素的CAR， 所述CAR的结构 包括特异性靶 向间皮素的抗原识别区； 还包括以下(i)至(v)特 征中的至少一种： (i)CD8胞外先导序列； (ii)来 自CD8的铰链； (iii)CD8/CD28跨膜 区； (iv)胞内 段共刺激信号41BB； (v)CD3ζ的胞浆信号传导序 列。 本发明的CAR ‑NK细胞能够有效靶向间皮素高 表达的肿瘤细胞， 其对高表达间皮素肿瘤有较好 的靶向杀伤作用， 且具有较高的特异性和安全 性， 为该类肿瘤患者提供新的免疫细胞治疗药 物。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图6页 CN 114250201 A 2022.03.29 CN 114250201 A 1.一种CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述CAR ‑NK细胞为在NK细胞表面表达靶向间皮素的 CAR， 所述CAR的结构包括特异性靶向间皮素的抗原 识别区； 还包括以下(i)至(v)特 征中的至少一种： (i)CD8胞外先导序列； (ii)来自CD 8的铰链； (iii)CD8/CD28跨膜区； (iv)胞内段共刺激信号 41BB； (v)CD3ζ 的胞浆信号传导序列。 2.根据权利要求1所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述CAR的结构包括如SEQ  ID No.1 所示的氨基酸序列。 3.根据权利要求1所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述CAR ‑NK细胞为脐带血来源CAR ‑ NK细胞。 4.权利要求1至3任一项所述的CAR ‑NK细胞的制 备方法， 其特征在于， 所述CAR ‑NK细胞 通过NK细胞转染表达所述CAR的载体得到 。 5.根据权利要求 4所述的制备 方法， 其特 征在于， 具体包括以下步骤： S1、 利用NK磁珠分离脐带 血中的NK细胞； S2、 将表达所述CAR的载体通过慢病毒感染激活NK细胞， 添加I L‑2用于激活； S3、 培养至约第14天收获所述细胞CAR ‑NK细胞。 6.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 还包括： 使用重组人纤维蛋白片段包 被非TC处 理的细胞培 养板和/或使用包 含IL‑2的SCGM培养基进行细胞培 养。 7.根据权利要求4至6任一项所述的制备方法， 其特征在于， 所述载体包含表达所述CAR 结构的核苷酸序列； 还 包括以下(a)至(c)特 征中的至少一种： (a)所述载体的骨架为慢病毒Lenti载体； (b)Lenti ‑EF1α启动子； (c)所述CAR结构N端装载表达fla g的序列。 8.根据权利要求7所述的制备方法， 其特征在于， 所述载体包含如SEQ  ID No.2所述的 核苷酸序列。 9.权利要求1至 3任一项所述的CAR ‑NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述抗肿瘤药物为能够治疗靶向间皮素 的肿瘤的药物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114250201 A 2一种CAR‑NK细胞及其制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技 术领域， 具体涉及一种CAR ‑NK细胞及其制备 方法与应用。 背景技术 [0002]嵌合抗原受体(chimeric  antigen receptor， CAR)是基于基因工程改造并表达于 细胞表面的受体蛋白， 由抗原识别区(single  chain variable  fragment， scFv)、 铰链区、 跨膜区和胞内信号转导区组成。 通过病毒感染或电转等方式使嵌合抗原受体表达在免疫细 胞的表面从而构建成CAR ‑免疫细胞。 CAR ‑T细胞治疗是近年来兴起的一种新的癌症治疗手 段， 也是当前抗肿瘤免疫治疗中的研究热点， 通过基因工程方法改造免疫细胞， 已成为肿瘤 免疫细胞治疗的趋势。 然而， CAR ‑T细胞在实体瘤 治疗中仍然存在诸多障碍， 例如在CAR ‑T细 胞治疗安全性方面， 在治疗中常会发生脱靶效应和产生细胞因子风 暴。 [0003]NK细胞作为天然免疫系统中重要的一员， 同样能够通过CAR修饰增强其抗肿瘤能 力的效应细胞。 NK细胞与T细胞相比具有以下优点： 第一， 同种异体来源的CAR ‑NK移植物抗 宿主病的风险降低， 细胞因子释放综合征(Cytokine  Release Syndrome， CRS)和神经毒性 较少； 第二， 除了CAR靶向杀死肿 瘤靶细胞外， 还存在其他杀伤肿 瘤方式， 通过CAR依赖性和 NK细胞受体依赖机制杀伤肿瘤， 因此CAR修饰的NK细胞可能能够有效地消除异质性； 第三， 同种异体NK细胞来源丰富， 容易获取， 能够大规模获取NK细胞， 使得CAR ‑NK细胞有机会 大规 则临床使用， 并且 可以提供消除个性化的产品， 解决困扰着当前的CAR ‑T细胞疗法基于个体 的自体免疫细胞治疗产品处 理起来比较复杂的难题。 [0004]但目前免疫CAR ‑NK细胞的开发和应用较少， 因此， 开发新型的CAR ‑NK细胞用于肿 瘤等疾病的治疗具有十分重要的意 义。 发明内容 [0005]本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提出一 种CAR‑NK细胞， 能够特异性靶向间皮素， 有效治疗肿瘤等疾病。 [0006]本发明还提出 上述CAR‑NK细胞的制备 方法。 [0007]本发明还提出 上述CAR‑NK细胞的应用。 [0008]根据本发明的一个方面， 提出了一种CAR ‑NK细胞， 所述CAR ‑NK细胞为在NK细胞表 面表达靶向间皮素的CAR， 所述CAR的结构包括特异性靶向间皮素的抗原识别区； 还包括以 下(i)至(v)特征中的至少一种： (i)CD8胞外先导序列； (ii)来自CD8的铰链； (iii)CD8/CD28 跨膜区； (iv)胞内段共刺激信号 41BB； (v)CD3ζ 的胞浆信号传导序列。 [0009]根据本发明的一种具体的实施方式， 至少具有以下有益效果： 本发明的CAR ‑NK细 胞能够有效靶向间皮素高表达的肿瘤细胞， 其对高表达间皮素肿瘤有较好的靶向杀伤作 用， 且具有较高的特异 性和安全性， 为该类肿瘤患者提供新的免疫细胞治疗 药物； 该CAR ‑NK 细胞能够制备成 “货架式产品 ”， 冻存于液氮罐， 满足患者随时需要， 减少等待时间。 [0010]在本发明中， CAR ‑NK细胞相较于CAR ‑T细胞至少具有以下优点： (1)NK细胞属于人说　明　书 1/7 页 3 CN 114250201 A 3