(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111290816.9 (22)申请日 2021.11.02 (71)申请人 北京双因生物科技有限公司 地址 100070 北京市丰台区科 学城海鹰路8 号2号楼1层109室 (72)发明人 解晶　段海峰　张艳春　张晶　 程露　姚雨杉　孟文华　杨继业　 (74)专利代理 机构 北京康思博达知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11426 专利代理师 刘冬梅 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01)C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种IL-12和IL-18变体的融合蛋白及其制 备方法和用途 (57)摘要 本发明公开了一种IL ‑12和IL‑18变体的融 合蛋白及其制备方法和用途。 本发 明的融合蛋白 包含第一结构域： 其包括IL ‑18和/或其变体； 第 二结构域： 其包 括IL‑12p40和/或IL ‑12p35。 本发 明的融合蛋白能够在体内和体外都特异性激活 NK细胞， 从而实现其杀肿瘤的作用。 本发明还提 供了一种低成本的体外高效扩增NK细胞的方法， 适合于临床过继性 NK细胞疗法的使用。 权利要求书1页 说明书12页 序列表29页 附图5页 CN 114853899 A 2022.08.05 CN 114853899 A 1.一种融合蛋白， 其特 征在于， 包括至少二个结构域， 其中 第一结构域： 其包括 IL‑18和/或其变 体； 第二结构域： 其包括 IL‑12p40和/或I L‑12p35。 2.根据权利要求1所述的融合蛋白， 其特 征在于， 当第二结构域包括IL ‑12p40和IL‑12p35时， IL ‑12p40和IL‑12p35两者之间通过连接子 连接或者 不连接。 3.根据权利要求1所述的融合蛋白， 其特征在于， 还包括： 连接结构域， 其用于连接所述 第一结构域和第二结构域， 包括人或动物的免疫球蛋白和/或其亚型和/或其变体、 人或动 物白蛋白和/或其变 体。 4.根据权利要求1所述的融合蛋白， 其特 征在于， IL‑18如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； 和/或 IL‑18变体如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列； 和/或 IL‑12p40如SEQ  ID NO:5所示的氨基酸序列； 和/或 IL‑12p35如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。 5.一种融合基因， 其特征在于， 含有权利要求1～4任一所述的融合蛋白的编码核苷酸 序列。 6.一种表达构建体， 其特征在于， 含有权利要求1～4任一所述的融合蛋白的编码核苷 酸序列。 7.一种融合蛋白的制备方法， 其特征在于， 包括将如权利要求1～4任一所述的融合蛋 白的编码核苷酸序列克隆至表达构建体的步骤。 8.根据权利要求7 所示的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1‑1)构建如权利要求1～4任一所述的融合蛋白的编码核苷酸序列； (1‑2)构建包 含步骤(1 ‑1)的编码核苷酸序列的表达构建体； (1‑3)将步骤(1 ‑2)的表达构 建体用于转染或转化宿主细 胞， 并使所述编码核苷酸序列 在宿主细胞中表达 。 9.一种NK细胞体外扩增 和培养方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (2‑1)分离单个核细胞； (2‑2)重悬单个核细胞： 第0天收集的单个核细胞， 用活化培养基重悬后， 转入培养瓶， 置于培养箱中培 养； (2‑3)诱导NK细胞： 第3天补加所述活化培 养基； (2‑4)扩增NK细胞： 第 5天后， 每1～3天补加扩增培养基， 并控制 细胞浓度在0.4～0.7 × 106/mL； 培养至第10～17天后将细胞培养液转入离心管， 离心、 洗涤， 获得高纯度， 高活性的 NK细胞； 其中所述活化培养基和/或所述扩增培养基 中添加有如权利要求1～4任一所述的融合 蛋白。 10.如权利要求1～4任一所述的融合蛋白、 如权利要求5所述的融合基因、 如权利要求6 所述的表达构建体在制备肿瘤药物中的应用； 和/或 如权利要求9所述的NK细胞体外扩增和培养方法制备的NK细胞在制备肿瘤药物中的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114853899 A 2一种IL‑12和IL‑18变体的融合蛋白及其制备方 法和用途 技术领域 [0001]本发明属于生物制药领域。 具体地， 本发明涉及一种IL ‑12和IL‑18变体的融合蛋 白及其制备 方法和用途。 背景技术 [0002]肿瘤免疫疗法在过去的几十年里取得了较大的发展， 包括使用细胞因子来激 活免 疫细胞、 免疫检查 点抑制剂、 溶瘤病毒、 肿瘤疫苗和过继性细胞免疫 治疗。 [0003]NK细胞介导的天然免疫反应在对抗病原微生物和肿瘤中起到重要的作用。 与T细 胞不同的是， NK细胞对肿瘤和病毒感染的细胞的杀伤并不需要接触到靶细胞抗原， 而是通 过释放穿孔素和颗粒酶B来杀伤靶细胞。 并且NK细胞通过分泌多种细胞因子如IFN ‑γ、 TNF‑ α、 IL‑13和GM‑CSF等与参与T ‑细胞识别感染的细胞或者与抗原呈递细胞(APC)相互作用。 NK 细胞在体内的激活可以通过膜结合的受体和由AP C分泌的细胞因子来 实现。 其中， 研究表明 IL‑18和IL‑12在增强NK细胞活性和刺激IFN ‑γ分泌以及调节后续免疫反应中起到重要作 用。 IL‑18具有IL ‑1蛋白质家族的结构特征， 但是IL ‑18本身不会诱导IFN ‑γ。 单独使用IL ‑ 12的毒副作用较大， 因此目前的临床实验主要 是与其他抗肿瘤的单克隆抗体或者免疫检查 点抑制剂联用， 而其有效性还未 可知。 [0004]目前有多种临床研究表明过继性NK细胞疗法能安全有效的对抗肿瘤。 然而这种疗 法的一大难点就是如何通过体外扩增的方法得到足够数目的激活的NK细胞来满足临床的 需求。 目前， NK细胞的体外扩增主要有3种： (1)通过磁珠分选的方法先从外周血单个核细胞 (PBMCs)或者脐带血中分离得到纯度较高的CD3 ‑CD56+的NK细胞， 再将这一群细胞扩大培 养。 此法的分选过程步骤繁琐且分选用的磁珠价格昂贵； (2)用修饰或者未修饰过的K562细 胞做饲养层细胞来培养。 此法获得的NK细胞在纯度和数量上有很好的效果， 但是用肿瘤细 胞做饲养层给临床的使用带来了风险。 (3)用抗CD3单克隆抗体和CD16单克隆抗体包被或者 不包被培养瓶， 并结合多种细胞因子如IL ‑2、 IL‑12、 IL‑15、 IL‑18和IL‑21等刺激NK细胞扩 增。 但此法得到的NK细胞 纯度和扩增倍数都有限。 [0005]因此找到一种优化的方法来制备NK细胞对过继性 NK细胞疗法至关重要。 发明内容 [0006]因此， 本发明的目的是针对现有技术的不足， 提供一种同时具有IL ‑12和IL‑18活 性的融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法和用途。 本发明提供的融合蛋白能够在体内和体 外都特异性激活NK细胞， 从而实现其杀肿瘤的作用。 本发明还提供了一种低 成本的体外高 效扩增NK细胞的方法， 适 合于临床过继性 NK细胞疗法的使用。 [0007]具体来说， 本发明的目的在于提供以下 方面： [0008]第一方面， 本发明提供一种融合蛋白。 该融合蛋白包括至少二个结构域， 其中 [0009]第一结构域： 其包括 IL‑18和/或其变 体； [0010]第二结构域： 其包括 IL‑12p40和/或I L‑12p35。说　明　书 1/12 页 3 CN 114853899 A 3