(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111420354.8 (22)申请日 2021.11.26 (71)申请人 苏州方舟生物科技有限公司 地址 215126 江苏省苏州市工业园区青丘 街277号 (72)发明人 王含璐　秦蒙　苏昕　蒋永平　 (74)专利代理 机构 江苏圣典律师事务所 32 237 代理人 肖明芳 (51)Int.Cl. A61K 47/54(2017.01) A61K 47/69(2017.01) A61K 31/7088(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 49/00(2006.01)B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) C12P 19/34(2006.01) (54)发明名称 一种RA16-A与 DNA四面体载体共聚物及其制 备方法和应用 (57)摘要 本发明公开一种RA16 ‑A与DNA四面体载体共 聚物， 所述RA16 ‑A序列为RA16在3 ’端添加20个 poly A， DNA四面体载体的四条单链DNA的核苷酸 序列分别如SEQ  ID NO： 1‑4所示， RA16 ‑A与DNA四 面体载体的摩尔比为1:1。 本发明解决了双特异 性RNA适配体RA16在体内循环时间短、 易降解的 问题， 利用DNA纳米结构负载的RA16可以显著提 高RA16在细胞、 体内靶组织的循环时间， 提高 RA16在细胞或肿瘤组织中的富集度和存活时间， 成功实现了RA16在肿瘤区域的长富集， 可作为肿 瘤诊断试剂用于活体成像。 此外， 该核酸适配体 本身可以抑制肿瘤细胞生长， 通过与DNA四面体 偶联， 可进一步装载肺癌化疗药物、 siRNA、 单克 隆抗体等， 实现长效的靶向给药。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图3页 CN 114099695 A 2022.03.01 CN 114099695 A 1.一种RA16 ‑A与DNA四面体载体共聚物， 其特征在于， 所述RA16 ‑A为在RA16  3’端添加 20个poly  A， DNA四面体载体的四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO： 1‑4所示， 其 中， 所述四条单链DNA中的任意一条在3 ’端添加20个poly  T， RA16‑A与DNA四面体载体的摩 尔比为1:1。 2.根据权利要求1所述的RA16 ‑A与DNA四面体载体共聚物， 其特征在于， 所述四条单链 DNA和RA16 ‑A中的任意 一个在共聚前 先进行荧 光标记。 3.根据权利要求2所述的RA16 ‑A与DNA四面体载体共聚物， 其特征在于， 所述荧光标记 为FITC、 Alexa  488、 Cy3、 Cy5和Cy7中的任意 一种。 4.权利要求1所述的RA16 ‑A与DNA四面体载体共聚物的制备方法， 其特征在于， 包括如 下步骤： （1） RA16 ‑A的合成： 通过PCR合成相应的模板链DA16 ‑T， 然后经体外转录得到； （2） DNA纳米载体对RA16 ‑A的负载： 利用PCR程序升温后退火将两两互补的四条单链DNA 与RA16‑A通过碱基互补完成负载， 得到RA16 ‑A与DNA四面体载体共聚物， 其中， 四条单链DNA 的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO： 1‑4所示。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 退火程序为： 80~95℃ 10~20 min， 4℃ 30 ~40 min。 6.权利要求1所述的RA16 ‑A与DNA四面体载体共聚物在制备靶向非小细胞型肺癌的诊 断试剂中的应用。 7.权利要求1所述的RA16 ‑A与DNA四面体载体共聚物在制备用于抑制非小细胞型肺癌 的药物中的应用。 8.权利要求1所述的RA 16‑A与DNA四面体载体共聚物在生物检测、 活体成像、 基因载体、 药物传递中的应用。 9.一种靶向非小细胞型肺癌的药物， 其特征在于， 其为权利要求1所述的共聚物与非小 细胞型肺癌的化疗药物、 siRNA或单 克隆抗体中的任意 一种的复合物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114099695 A 2一种RA16 ‑A与DNA四 面体载体共聚物及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物纳 米医药领域， 具体涉及一种靶向递送体系， 更具体地， 本 发明涉 及一种RA16 ‑A与DNA四面体载体共聚物及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]肺癌是全世界癌症死亡的最常见原因。 非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌病例的   85％–90％。 传统的癌症疗法(如化疗和放疗)会出现严重的副作用， 包括 胃肠道不适、 器官 损伤并且严重影响生活质量。 [0003]目前针对非小细胞肺癌的新疗法， 在过去的几十年中， 表皮生长因子受体(EGFR)   酪氨酸激酶抑制剂(T KIs)最常用于肺癌治疗。 这些抑制剂用于含有E GFR突变的晚期非小细 胞肺癌患者与化疗相比大大降低了周身毒性， 显著提高了病 人生存率， 因此靶向治疗十分 必要。 [0004]适配体是一类单链的寡核苷酸片段(D NA或RNA)， 在生物环境中能够折叠 成特定的 空间结构， 通过空间互补、 静电作用、 范德华力、 氢键等作用， 可与特定的靶标高度亲和的结 合。 由于适配体具有与靶物质结合的特异 性， 与抗体相比， 其分子量更小， 易于合成， 又无免 疫原性； 与同为核酸的小干扰RNA(siRNA)等相比， 其作用形式和作用范围更为多样， 因此， 适配体非常具有开发为特异性的与靶组织结合的靶向诊断或靶向治疗制剂的价值。 同时， 适配体分子量小、 易于通过化学合成， 便于储存和运输， 无论和抗体还是同为核酸的小核酸 比， 都有一定的优势， 因此， 适配体被广泛应用于体外诊断、 体内成像和靶向制剂的开 发中。 截至目前， RNA适配体药物在一些疾病的诊断和治疗领域已取得了不错的成效。 FDA已批准 了Eyetch/Pfizer开发的针对VEGF的核酸适配体——pegaptanib(商 品名Macugen)用于治 疗年龄相关性黄斑病症。 [0005]在此前的研究中， 我们研发团队报道了首例利用聚乙二醇(PEG)修饰的RNA文库， 直接在人非小细胞肺癌荷瘤裸鼠体内开展的活体SELEX技术， 富集到对于人非小细胞肺癌 具有靶向及抑瘤双特异功能的RNA适配体RA16(CN201610168486.9)。 该技术不仅有效降低 了以往在体外筛选过程中筛选文库与高丰度非靶蛋白的非特异 性结合， 提高了与原 位组织 特异性结合靶序列的筛选概率和 针对性， 而且， 由于在筛选的过程中引入了PEG修饰， 筛选 到的RNA适配体更容易进 行各种修饰和 偶联， 而不易在修饰过程中丧 失其生物学特性， 具有 极大的后期开发潜力。 然而， 尽管我们已对  RA16进行了部分修饰， 增强了其组织稳定性和 半衰期， 由于RNA自身易降解、 易清除的特性， 我们仍需继续探索并进一步提高其稳定性、 载 药能力及生物相容 性， 进一步开发更适用于临床的纳米级靶向药物递送系统。 [0006]尽管目前已经通过SELEX技术筛选出了不少核酸适配体， 然而真正进入临床诊断 和靶向治疗的核酸适配体却屈指可数， 不少大量费时费力筛选出的核酸适配体由于稳定性 差等因素并不能真正应用到临床诊断与治疗工作中去。 因此利用药物递送系统增加体内循 环的半衰期， 增加药物稳定性成为一种可实现的方法， 而与合成材料相比， 来源于内源性材 料的载体优越的生物相容性在纳米医学 的发展中非常有利。 因此利用具有纳米级尺寸、 高说　明　书 1/9 页 3 CN 114099695 A 3