(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111362315.7 (22)申请日 2021.11.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113952466 A (43)申请公布日 2022.01.21 (73)专利权人 烟台大学 地址 264003 山东省烟台市莱山区清泉路 30号 专利权人 潍坊中医药产业 技术研究院 　 中国海洋大学 (72)发明人 陈大全　刘雪　郭春静　李毅　 于采薇　陈强　苏彦国　郭慧敏　 孔明　 (74)专利代理 机构 北京中济纬天专利代理有限 公司 11429 专利代理师 潘剑敏 (51)Int.Cl. A61K 47/61(2017.01) A61K 47/54(2017.01) A61K 31/202(2006.01)A61P 35/00(2006.01) C08B 37/00(2006.01) (56)对比文件 CN 108904 447 A,2018.1 1.30 CN 108752542 A,2018.1 1.06 CN 108559039 A,2018.09.21 CN 110204569 A,2019.09.0 6 US 2021187170 A1,2021.0 6.24 AU 2006203314 A1,20 06.08.24 Zhukang Du et al. .Dual stimul i- responsive nan o-structure transiti on of three-arm branc hed amphiphi lic polymers containing ferrocene (Fc) and azobenzene (Azo) mo ieties i n aqueous so lution. 《Soft Matter》 .2019,第15卷(第2019期),第8 855-8864 页. 任碧野等.二茂铁 基偶氮苯甲酸溶 液的光化 学和电化学 行为. 《华 南理工大 学学报(自然科 学 版)》 .2010,(第08 期), 审查员 彭翠莲 (54)发明名称 一种乏氧响应增敏铁死亡的当归多糖衍生 物的制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种乏氧响应增敏铁死亡的 当归多糖衍生物的制备方法； 包括： 步骤1， 载体 材料的合成： 先进行当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸的 合成， 然后当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸 ‑二茂铁甲醇 的合成， 最终形成花生四烯酸 ‑当归多糖 ‑偶氮苯 二甲酸‑二茂铁甲醇； 步骤2， 将载体材料进行透 析、 冻干处理。 本发明制备方法中外源性铁二茂 铁的引入， 铁死亡前体花生四稀酸的引入， 及偶 氮苯键降解引起的NADPH的消耗， 选择性增敏铁 死亡， 协同促进癌细胞死亡。 本发明制备方法中 所涉及的偶氮苯键的还原导致肿瘤NADPH的衰 竭， 进而降低胞内GSH和Trx的浓度， 升高胞内ROS浓度， 间接促进肿瘤细胞铁死亡。 本发明基于当 归多糖的肝靶向性及被动靶向性， 实现衍生物的 精准肿瘤靶向递药的目的。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 113952466 B 2022.11.01 CN 113952466 B 1.一种乏氧响应增敏铁死亡的当归多糖衍生物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 步骤1， 载体材 料的合成： 先进行当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸的合成， 然后当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸 ‑二茂铁甲醇的合成， 最终形成花 生四烯酸 ‑当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸 ‑二茂铁甲醇； 步骤2， 将载体材 料进行透析、 冻干处 理； 步骤1中， 所述当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸的合成的方法具体包括： （1） 将54.048  mg偶氮苯二甲酸溶于2ml  DMSO， 超声溶解10min， 转移至25ml棕色 圆底烧 瓶， 放入转子， 加盖橡胶塞， 封口膜封口， 置于30℃油浴锅进行反应； EP管称量46mg  EDC、 24.43mg DMAP,1.5ml  DMSO超声溶解， 加入棕色圆底烧瓶， 反应3 h； （2） 称取60 mg的ASP于4  ml EP管， 加入3  ml DMSO超声 或水浴溶解， 直至溶解完全， 2ml 吸管吸取逐滴加入步骤 （1） 的棕色圆底烧瓶中， 加入40 μ的三乙胺， 封口继续反应24h， 所得 即ASP‑AZO； 步骤1中， 所述当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸 ‑二茂铁甲醇的合成方法为： 通过酯化反应， 将 二茂铁甲醇的羟基与偶氮苯二甲酸的羧基连接， 共价连接亲水段， 形成主链当归多糖 ‑偶氮 苯二甲酸 ‑二茂铁甲醇； 所述当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸 ‑二茂铁甲醇的合 成方法具体步骤为： 称取41.60  mg的二茂铁甲醇于4ml  EP管， 2ml  DMSO进行超声溶解至溶解完全， 用2ml吸管逐 滴加入装有ASP ‑AZO的棕色圆底烧瓶中， 并加入40 μ 的三乙胺， 封口并调整温度至35℃， 反应 5h， 所得即ASP‑AZO‑Fc； 步骤1中， 所述花生四烯酸 ‑当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸 ‑二茂铁甲醇的合成方法为： 将花 生四烯酸中加入EDC、 HOBt， 其中AA、 EDC和HOBt的质量比为1: 1.5:1.2， 进行2h的羧基活化， 转移至上述装有ASP ‑AZO‑Fc的棕色圆底烧瓶中继续反应5h， 形成最终载体材料AA ‑ASP‑ AZO‑Fc。 2.如权利要求1所述的乏氧响应增敏铁死亡的当归多糖衍生物的制备方法， 其特征在 于， 步骤2中， 所述透析具体为： 剪取8cm长度的透析袋,放入1000  ml的大烧杯， 加 入适量烧 开的去离 子水， 浸泡透析袋3 0 min至其变软； 以双股线对透析袋一端进行封 口处理， 进而用吸管吸取烧瓶内AA ‑ASP‑AZO‑Fc的反应 溶液转移入透析袋， 对另一端 进行封口， 并添加去离 子水至80 0 ml； 放入3cm橄榄球磁转子， 置于恒温磁力搅拌器上， 外罩黑色塑料袋， 进行避光透析； 开始 2h换一次水， 换3 ‑4次， 之后4h换一次水， 直至 透析至无味道存在。 3.如权利要求1所述的乏氧响应增敏铁死亡的当归多糖衍生物的制备方法， 其特征在 于， 步骤2中， 所述冻干具体为： 将透析好的AA ‑ASP‑AZO‑Fc的反应液转移至10  mlEP管， 1500   rpm, 离心5min， 取上清， 并过0.8  μm滤膜， 转移至蒸发皿， 覆以保鲜膜， 并进行扎空处理， ‑ 20℃冰箱预冻24h， 进行冷冻干燥。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113952466 B 2一种乏氧响应增敏铁死亡的当归多糖衍生物的制备方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物医学技术领域； 尤其涉及 一种乏氧响应增敏铁死亡的当归多糖衍 生物的制备 方法。 背景技术 [0002]近年来， 多糖类化合物是新世纪研究领域最活跃的方向之一， 特别是天然大分子 的植物多糖的结构和药 理活性的研究。 当归为伞 形科植物， 入肝、 脾， 具有补血 活血、 保肝护 脾等功效， 为临床使用频率最高的中药之一， 素有 “十方九归”之称， 而当归多糖是当归主要 活性成分。 现有的 由于当归多糖的肝靶向性， 有一定治疗肝癌效果， 但是效果 不显著。 [0003]肿瘤乏氧微环境中的免疫抑制细胞、 肿瘤干细胞、 循环肿瘤细胞等能介导免疫抑 制和免疫耐受， 促进肿瘤的发展， 导致肿瘤治疗预后差及治疗抗性。 基于此， 通过当归多糖 肝靶向性及肿瘤乏氧微环境相结合， 构建乏氧响应肝靶向当归多糖新的衍生物实现肝癌靶 向特异性治疗。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供了一种乏氧响应增敏铁死 亡的当归多糖衍 生物的制备 方法。 [0005]本发明是通过以下技 术方案实现的： [0006]本发明涉及 一种乏氧响应增敏铁死亡的当归多糖衍生物的制备方法， 包括以下步 骤： [0007]步骤1， 载体材料的合成： 先进行当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸的合成， 然后当归多糖 ‑ 偶氮苯二甲酸 ‑二茂铁甲醇的合成， 最 终形成花生四烯 酸‑当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸 ‑二茂铁 甲醇； [0008]步骤2， 将载体材 料进行透析、 冻干处 理。 [0009]优选地， 步骤1中， 所述当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸的合成方法为： 以具有肝靶向特性 的当归多糖为亲水性嵌段， 通过酯化反应连接偶氮苯二甲酸 乏氧敏感键， 同偶氮苯二甲酸 质量比为1:1， 制备亲水组分ASP ‑AZO； 偶氮苯二甲酸以溶剂二甲基亚砜DMSO溶解， 并加入相 应当量的EDC、 DMAP， 其中ASP、 EDC和DMAP的质量比为1: 1.2:1， 于30℃油浴锅反应2h进行羧 基的活化。 [0010]优选地， 所述当归多糖 ‑偶氮苯二甲酸的合成的方法具体包括： [0011](1)将54.048mg偶氮苯二甲酸溶于2ml  DMSO， 超声溶解10min， 转移至25ml棕色圆 底烧瓶， 放入转子， 加盖橡胶塞， 封口膜封口， 置于30℃油浴锅进行反应； EP管称量46mg   EDC、 24.43mg  DMAP,1.5ml  DMSO超声溶解， 加入棕色圆底烧瓶， 反应3 h； [0012](2)称取60mg的ASP于4ml  EP管， 加入3ml  DMSO超声或水浴溶解， 直至溶解完全， 2ml吸管吸取逐滴加入步骤(1)的棕色圆底烧瓶中， 加入40 μ 的三乙胺， 封口继续反应24h， 所