(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111364796.5 (22)申请日 2021.11.17 (71)申请人 中国科学院昆明动物研究所 地址 650223 云南省昆明市五华区教场东 路32号 (72)发明人 杨翠萍　陈勇彬　熊秋霞　 (74)专利代理 机构 昆明同聚专利代理有限公司 53214 代理人 苏芸芸 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种人PKM YT1AR基因及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种人PKMYT1AR基因， 其核苷 酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 本发明将检测人 PKMYT1AR基因表达量的试剂应用在制备非小细 胞肺癌临床诊断试剂中， 人PKMYT1AR基因表 达水 平高低与非小细胞肺癌临床预后呈负相关性， 实 验结果显示人PKMYT1AR基因在非小细胞肺癌细 胞系中较正 常肺上皮细胞表 达高； PKMYT1AR基因 敲低后， 非小细胞肺癌细胞系的增殖受到显著抑 制， 细胞周期阻滞在G0/G1期； 可明显增加非小细 胞肺癌临床铂类化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作 用； 本发明揭示了PKMYT1AR基因是 非小细胞肺癌 的潜在风险基因， PKMYT1AR表达抑制与放疗或化 疗药物DDP联用， 加强非小细胞肺癌的临床治疗 效果。 权利要求书1页 说明书15页 序列表3页 附图11页 CN 114231529 A 2022.03.25 CN 114231529 A 1.一种人PKM YT1AR基因， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 2.检测权利 要求1所述的人PKMYT1AR基因表达量的试剂在制备非小细胞肺癌临床诊断 试剂中的应用。 3.根据权利 要求2所述的应用， 其特征在于： 检测人PKMYT1A R基因表达量的试剂是检测 人PKMYT1AR基因高表达量的试剂。 4.根据权利 要求3所述的应用， 其特征在于： 试剂包括引物， 引物序列如SEQ  ID NO:2和 SEQ ID NO:3所示。 5.以抑制 人PKMYT1AR基因表达或敲低人PKMYT1AR基因为目的的筛选用于制 备非小细 胞肺癌治疗药物的应用。 6.根据权利要求5述的应用， 其特征在于： 将抑制 人PKMYT1AR基因表达 的shRNA序列克 隆入慢病毒载体后获得RNA干扰慢病毒， 用于筛选非小细胞肺癌治疗药物， 表达shRNA的序 列包括两个靶向人PKMYT1AR基因编码DNA的反向重复序列， 中间由一茎环序列分隔； 其中， 两个反向重复序列分别为人PKMYT1AR基因的shRNA靶点序列及其互补序列； 所述人 PKMYT1AR基因的shRNA靶点核苷酸序列选自下述核苷酸序列： SEQ ID NO:4： GCT TAGCTTCCTCTTGAAGGA； SEQ ID NO:5： GCCTTCCTTACGCAGAGA ATG。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于： 表达shRNA的序列的正义链序列如SEQ  ID  NO:6所示， 反义链序列如SEQ  ID NO:7所示； 或者正义链序列如SEQ  ID NO:8所示， 反义链序 列如SEQ ID NO:9所示。 8.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 将抑制 人PKMYT1AR基因表达的ASO序列用 于筛选非小细胞肺癌治疗药物， ASO核苷酸序列选自下述序列： SEQ ID NO:10： GGCCTTGAAGCTGGAGTGCA； SEQ ID NO:11： CCATATCTGTAT TTCTGGT。 9.以敲低或抑制人PKMYT1AR基因表达为目的的方法或药物在增加 非小细胞肺癌治疗 效果中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114231529 A 2一种人PKMY T1AR基因及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种基因及其新用途， 尤其是人PKMYT1AR基因及其在肿瘤临床诊断以 及药物筛选中的用途， 具体涉及人PKMYT1AR基因在非小细胞肺癌临床诊断以及药物筛选中 的应用。 背景技术 [0002]肺癌是一种起源于支气管粘膜或腺体的致命恶性肿瘤， 可分为小细胞肺癌(SCLC： small cell lung cancer)和非小细胞肺癌(NSCLC： non ‑small cell lung cancer)。 SCLC 和NSCLC约分别占肺部的20％和80％癌症病例， 而NSCLC可以进一步细分为腺癌(LUAD)、 鳞 状细胞癌(LUSC)和大细胞肺癌。 肺癌早期治疗方案是基于手术的综合治疗， 多学科治疗在 晚期非小细胞肺癌治疗中发挥重要作用， 放疗、 化疗、 免疫治疗、 靶向治疗或联合治疗是目 前主要的治疗 策略。 NSCLC的发病率相对较高， 近年来， 随着诊断和治疗 策略的提升， 非小细 胞肺癌的治疗有了很大的改善， 但5年生存率低于17％。 因此， 仍然有必要研究调节肺癌进 展的分子 机制， 以期发现新的治疗 靶点， 改善临床结果。 [0003]长链非编 码RNA(lncRNA： Long  non‑coding RNAs)是超过200个核苷酸且几乎没有 蛋白质编码潜力的核苷酸链， 虽然这些lncRNA的功能重要性和分子机制还有待进一步研 究。 LncRNA可通过不同的机制调节肿瘤进展， 其中LncRNA作为竞争内源性RNA(ceRNA)的功 能， 作为"微RNA(miRNA)海绵"消除miRNA介导的对靶向基因的抑制而备受关注。 微RNA是一 类短(平均18 ‑25核苷酸)内源性RNA， 可以通过与目标mRNA  3'非翻译区(3 ’ ‑UTR)结合， 抑制 目标mRNA的稳定性和转化效率从而调节基因表达的RNA。 因此， miRNA可以减少抑癌基因的 表达， 或增加促癌基因表达促进肺癌的发生或进展。 基于非编 码RNA参与调节 化疗或放射治 疗敏感性， 以及 靶向药物的治疗， 已经开 发了以核酸为基础的策略， 要么通过控制lncRNA的 表达水平或针对靶向RNA修改原生结构。 其中， 基于RNA干扰(RNAi)技术和抗顺义寡核苷酸 (ASO)被广泛应用。 [0004]越来越多的研究表明， 肿瘤干细胞具有干细胞的生物学特性， 例如， 其有自我更新 和分化能力， 并与肿瘤的转移和耐药有重要的关系， 具有重要的临床意义。 然而其潜在的分 子机制尚不明确。 另外， 许多有案可查的发现表明， 在肿瘤的进展 过程中， lncRNA或miRNA在 肿瘤干细胞中发挥着至关重要的作用。 分子机制研究发现， 在正常干细胞自我更新中发挥 重要功能的多条信号通路， 如Wnt/b ‑catenin、 Hedgehog和Notch信号通路等在肿瘤干细胞 的干性维持中都发挥了关键作用， 并挖掘到了各种肿瘤干细胞的标志物基因， 如CD133、 CD44、 ALCAM and CD90等。 [0005]PKMYT1是一种膜相关酪氨酸/苏氨酸1蛋白激 酶， 是WEE家族激 酶的成员之一， 在细 胞周期转换过程中抑制C dk1磷酸化。 之后， 多项研 究发现PKMYT1在不同类型的人类癌症中 发挥致癌作用。 然而在肺癌中PKMYT1表达如何上调， 及其特异的下游靶基因的潜在机制仍 然不清楚。说　明　书 1/15 页 3 CN 114231529 A 3