(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111419857.3 (22)申请日 2021.11.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113827568 A (43)申请公布日 2021.12.24 (73)专利权人 山东大学 地址 250012 山东省济南市历下区文化西 路44号山东大学趵突泉校区药 学院 (72)发明人 林贵梅　傅相蕾　邱胜男　 (74)专利代理 机构 济南格源知识产权代理有限 公司 373 06 专利代理师 许静 (51)Int.Cl. A61K 9/127(2006.01) A61K 45/00(2006.01)A61K 31/704(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 5/071(2010.01) C12N 5/09(2010.01) 审查员 杜正午 (54)发明名称 一种内质网膜融合脂质体及其制备方法和 应用 (57)摘要 本发明涉及一种内质网膜融合脂质体及其 制备方法和应用， 属于生物技术领域。 步骤为： （1） 内质网膜的提取； （2） 脂质体的制备和表征； （3） 内质网膜融合脂质体的制备和表征。 本发明 使用薄膜分散法制备的脂质体粒径控制在 103.03±7.99nm， 粒径分布窄， PDI=0.149 ± 0.02， zeta电位为41.8 ±2.71mV。 与内质网膜融 合后， 最终的内质网膜融合脂质体 （EM/Lip） 粒径 控制在124.27 ±4.21nm， PDI=0.19 ±0.03， zet a 电位为14.27 ±2.50mV。 本发明中EM/Lip进入细 胞后大部分定位于内质网， 极少进入溶酶体， 从 而避免药物在溶酶体的降解， 实现了内质网的靶 向功能。 本发 明获得的内质网膜融合脂质体可以 在免疫细胞和肿瘤细胞的内质网靶向功能， 激光 共聚焦的三维图像技术也良好应用于亚细胞器 水平纳米制剂分布的研究。 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 CN 113827568 B 2022.07.26 CN 113827568 B 1. 一种内质网膜融合脂质体的制备 方法， 其特 征在于， 所述制备 方法步骤如下： （1） 内质网膜的提取 准备T75培养瓶的B 16F10或者DC2.4细胞， 计数3*107‑7*107， 用PBS缓冲液洗涤两 次后， 使用胰蛋白酶乙二胺四乙酸盐酸盐消化 1‑4min， 加入完全培养基终止消化  ， 收集细胞消化 液离心5‑10min； 弃上清， 保留细胞沉淀； 加入 预冷的研磨缓冲液和蛋白酶抑制剂， 转移到预 冷的DOUNCE匀浆器中， 冰上匀浆20 ‑50下， 直到显微镜下观察大部分细胞裂解； 将匀浆物转 移到离心管中， 4℃离心1000g去除细胞核和细胞碎片， 收集上清液； 然后将上清液4℃、 12000g离心15 ‑40min， 收集上清液； 使用超速离心 机和配套管在4℃、 100000g ‑200000g条件 下再次离心  60‑120min， 抽取上清液， 沉淀 颗粒即为 粗提的内质网成分； （2） 脂质体的制备和表征 通过薄膜水化法、 反复冻融法、 硫酸铵梯度法或者 微流控制备脂质体； 针对脂溶性药物， 选用薄膜水化法制备脂质体， 具体为： 制备脂质体， 将含有摩尔比为 （1 ‑4） ： （0.5‑1.5） ： （0.15 ‑0.65） ： （0.5 ‑1.5） 的DOTAP， DOPE， DSPE ‑PEG， CHOL和占总磷脂质量为5% ‑15%之间的脂溶性药物溶解于氯仿， 在70 ‑ 100rpm， 20 ‑40℃条件下真空旋蒸后形成脂质薄膜， 然后在冰浴中20% ‑25%功率探头超声1 ‑ 5s， 30‑50℃下600 ‑1000rpm 与PBS水合， 搅拌30 ‑120min； 在30 ‑50℃恒温条件下用220nm的 聚碳酸酯膜过 滤器强制挤出 得到脂质体溶 液； 针对水溶性药物， 可以选用硫酸铵梯度法和反复冻融法来包载 药物制备脂质体； 针对mRNA， 可以采用微 流控法； （3） 内质网膜融合脂质体的制备和表征 脂质体与内质网膜融合的方法包括但不 限于超声融合、 反复多次冻融、 脂质挤压的方 法； 所述脂质体与内质网膜超声融合， 具体方法为： 将脂质体滴入内质网溶液中， Lip与EM中蛋白的浓度比为 （1 ‑10） ： （1‑2） ， 然后在30 ‑50 ℃超声混合1 ‑5分钟， 室温磁力搅拌15 ‑60min， 然后使用脂质体挤出机通过400nm或者200nm 聚碳酸酯膜连续 挤出。 2. 根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中准备T75培养瓶的细 胞， 计数5*107， 用PBS缓冲液洗涤两次后， 使用胰蛋白酶乙二胺四乙酸盐酸盐消 化2min， 加 入DMEM完全培养基终止消化  ， 收集细胞消化液离心5 min； 弃上清， 保留细胞沉淀； 加入 预冷 的研磨缓冲液和蛋白酶抑制剂， 转移到预冷的DOUNCE匀浆器中， 冰 上匀浆50下， 直到显微镜 下观察大部分细胞裂解； 将匀浆物 转移到离心管中， 4℃离心1000g去除细胞核和细胞碎片， 收集上清液。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中将上清液4℃、 12000g 离心25min， 收集上清液； 使用超速离心机和配套管在4℃、 100000g条件下再次离心60min， 抽取上清液。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中制备脂质体， 将含有摩 尔比为3： 1： 0.27： 1的DOTAP， DOPE， DSPE ‑PEG， CHOL溶解于氯仿， 80rpm， 40℃真 空旋蒸后形成 脂质薄膜。 5. 根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中然后在冰浴中25%功权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113827568 B 2率探头超声2s， 40℃下800rpm与  PBS水合， 搅拌60min； 在40℃恒温条件下用220n m的聚碳酸 酯膜过滤器强制挤出 得到脂质体溶 液。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中将脂质体滴入内质网 溶液中， Lip与EM中蛋白的浓度比为2： 1， 然后在40℃超声混合2mi n， 室温磁力搅拌3 0min。 7.如权利要求1 ‑6任一项所述制备 方法获得的内质网膜融合脂质体。 8.如权利要求7 所述内质网膜融合脂质体在制备递送药物中的应用。 9.如权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 所述药物为阿霉素或mRNA。 10.如权利要求7所述的内质网膜融合脂质体在制备靶向进入黑色素瘤细胞的包封药 物中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113827568 B 3