(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111282362.0 (22)申请日 2021.11.01 (71)申请人 南京蓝盾生物科技有限公司 地址 210000 江苏省南京市栖霞区纬地路9 号江苏生命科技园B5 栋6楼 (72)发明人 李俊　郭志刚　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 曹坤 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C07K 16/28(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/62(2006.01)C12N 15/867(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种分泌PD1抗体的靶向mesot helin的CAR- T细胞及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种分泌PD1抗体的靶向 mesothelin的CAR ‑T细胞及其制备方法。 属于医 药生物领域， 其中， 所述CAR ‑T细胞同时表达 MSLN‑CAR和PD1抗体； 步骤： 构建重组慢病毒质 粒； 制备重组慢病毒； 分离、 活化T细胞； 将重组慢 病毒感染T细胞； CAR ‑T细胞体外培养； CAR ‑T细胞 扩增； 收集CAR ‑T细胞。 本发明分泌的PD1抗体， 能 够特异性的与T细胞表面的PD1相结合， 阻断肿瘤 微环境中PD1/PDL1通路对T细胞的抑制作用， 进 而增强CART对肿瘤细胞的杀伤效果。 本发明还涉 及自分泌PD1抗体的靶 向人Mesothelin 的CAR‑T 细胞在抗肿瘤免疫 治疗药物中的应用。 权利要求书1页 说明书11页 附图3页 CN 114934019 A 2022.08.23 CN 114934019 A 1.一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR ‑T细胞， 其特征在于， 所述CAR ‑T细胞同时 表达MSLN‑CAR和PD1抗体； 其中， 所述P D1抗体的氨基酸序列如SEQ  NO.1所述； 所述表达的MSL N‑CAR和PD1抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO.8所述； 核酸序列如SEQ  ID NO.9所述。 2.根据权利要求1所述的一种分泌PD1抗体 的靶向mesothelin的CAR ‑T细胞， 其特征在 于， 所述MSL N‑CAR包括信号肽、 胞外区、 铰链区、 跨膜区、 共刺激信号 域及胞内信号结构域。 3.根据权利要求2所述的一种分泌PD1抗体 的靶向mesothelin的CAR ‑T细胞， 其特征在 于， 所述的信号肽为CD 8a信号肽， 其氨基酸序列如SEQ  NO.2所述； 所述胞外区为靶向mesothel in的scfv， 其氨基酸序列如SEQ  NO.3所述； 所述铰链区为CD 8a， 其氨基酸序列如SEQ  NO.4所述； 所述跨膜区为CD 8a， 其氨基酸序列如SEQ  NO.5所述； 所述共刺激信号 域为4‑1BB， 其氨基酸序列如SEQ  NO.6所述； 所述胞内信号结构域 为CD3zeta， 其氨基酸序列如SEQ  NO.7所述。 4.如权利要求1 ‑3所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于， 具体制备步骤如下： (1)、 构建携带MSL N‑CAR及PD1抗体核酸序列的重组慢病毒质粒； (2)、 将携带MSLN ‑CAR及PD1抗体 的的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞， 制备 可感染T细胞的重组慢病毒； (3)、 从供者 提供的外周血中分离PBM C， 使用磁珠分离、 活化T细胞； (4)、 将制备的可感染T细胞的重组慢病毒感染T细胞， 产生表达MSLN ‑CAR的同时分泌 PD1抗体的CAR ‑T细胞； (5)、 将得到的CAR ‑T细胞进行体外 培养； (6)、 将进行了体外 培养的CAR‑T细胞进行扩增； (7)、 收集表达 MSLN‑CAR的同时分泌P D1抗体的CAR ‑T细胞。 5.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体 的靶向mesothelin的CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于， 在步骤(1)中， 所述重组慢病毒质粒是： 重组后的复制缺陷型慢病毒质粒， 能将 外源片段整合入宿主基因； 所述重组慢病毒质粒 是二代或三代的慢病毒转基因质粒。 6.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体 的靶向mesothelin的CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 所述制备可感染T细胞的重组慢病毒 载体具体是： 重组慢病毒载 体将靶向MSL N的嵌合受体表达在T细胞表面， 同时分泌P D‑1抗体； 其中， 所述的P D‑1抗体为人P D‑1抗体。 7.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体 的靶向mesothelin的CAR ‑T细胞制备方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 所述的宿主细胞 是： 293FT或293T细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934019 A 2一种分泌PD1抗体的 靶向mesothelin的CAR ‑T细胞及其制备 方法 技术领域 [0001]本发明属于医药生物领域， 涉及一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的  CAR‑T细 胞及其制备 方法。 背景技术 [0002]嵌合抗原受体(CAR)是模拟T细胞受体功能的人工受体， 其融合了抗原与抗体或配 体与受体的识别和结合特异 性以及效应T细胞对被识别的肿瘤细胞的杀伤能力； CAR由CD8a 引导肽、 抗原识别区(配体或单链 抗体或Fab片段)、 跨膜区、 以及T细胞的一系 列信号转导区 (CD28， CD3， CD137胞内信 号传导结构域)依次连接而成。 T细胞经修饰后， 表面表达的CAR首 先通过抗原识别区与肿瘤细胞表面抗原结合， 然后通过其信号转导区将活化信号传递至胞 内， 靶向地激活T细胞对肿 瘤细胞杀伤活性。 将表达CAR的DNA序列克隆入慢病毒表达载体， 并感染从患者血中分离出的T细胞， 使T细胞表面表达相应的CAR， 再将此修饰的T细胞再输 回患者体内， 修饰后的T细胞可以在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞， 达到 清除肿瘤 细胞的效果。 [0003]虽然CAR‑T细胞免疫治疗在动 物模型和患者身上表现了令人振奋的作用， 但二代、 三代CAR‑T细胞在实体瘤治疗领域仍面临巨大挑战， 主要包括： 缺乏肿 瘤特异性抗原， 从而 存在攻击正常细胞引起严重副反应的风险； T细胞难以有效的到达肿 瘤部位， CAR ‑T细胞浸 润实体瘤的能力不足、 存活时间短， 以及一系列的免疫抑制分子及 免疫抑制肿瘤微环境等 均会限制CAR ‑T细胞的抗肿瘤疗效， 如T细胞膜蛋白3(TIM ‑3)、 淋巴细胞激活因子3(LAG ‑3)、 细胞毒性T  淋巴细胞 ‑4(CTLA‑4)、 程序性细胞死亡蛋白1(PD ‑1)及其两个主要配体PD ‑L1、  PD‑L2等。 [0004]肿瘤抑制性免疫微环境是CAR ‑T在实体瘤中疗效不佳的重要原因。 程序性死亡受 体1(PD‑1)是T细胞活化的负调节， 通过与其两个配体PD ‑L1、 PD‑L2 相互作用来限制T细胞 的活性。 抑制免疫负调控取得了突破性进展， 例如抗  CTLA‑4、 抗PD‑1、 抗PD‑L1等免疫检查 点单抗阻断质量， 开创了癌症治疗新时代。 目前应用于临床研 究的PD‑1或者PD‑L1抗体， 通 过阻断PD ‑1或者PD‑L1 通路， 部分恢复T细胞的功能， 使其能够继续杀伤肿瘤细胞具有治疗 多种类型肿瘤的潜力。 恶性黑色素瘤、 非小细胞肺癌、 头颈鳞状上皮细胞癌、 霍奇金淋巴瘤、 肾细胞癌、 结直肠癌、 卵巢癌等 都均显示良好的临床疗效。 且PD ‑1和PD‑L1 的单抗已被美国 食品药品监 督局(FDA)批准用于复发或难治性恶性 黑色素瘤或非小细胞肺癌的治疗。 [0005]MESOTHELIN是一种肿瘤相关抗原， 在大多数的恶性胸膜间皮瘤、 胰腺癌、 卵巢癌及 某些肺癌中有表达， 并且正常组织中表达范围窄、 表达量低。 因而可以作为恶性胸膜间皮 瘤、 胰腺癌、 卵巢癌的免疫 治疗靶点. [0006]本技术方案采用的是第四代的CAR结构， CAR ‑T细胞在识别Mesothelin的同时能够 分泌PD‑1抗体， 分泌的PD ‑1抗体可以阻断肿瘤细胞表面PD ‑L1分子与CAR ‑T细胞的结合， 从 而解除PD ‑L1对CAR‑T细胞的抑制作用， 本技术方案因此能够提高CAR ‑T细胞对肿瘤细胞的说　明　书 1/11 页 3 CN 114934019 A 3