(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111362279.4 (22)申请日 2021.11.17 (66)本国优先权数据 202110985011.X 2021.08.26 CN (71)申请人 山东兴瑞生物科技有限公司 地址 261500 山东省潍坊市高密市高新 技 术产业开发区 (72)发明人 刘明录　强邦明　韩庆梅　冯建海　 王立新　张传鹏　金海锋　王亮　 许淼　 (74)专利代理 机构 山东华君知识产权代理有限 公司 373 00 代理人 武欢欢 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01)C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种含有人PD1基因sgRNA的T细胞及其应用 (57)摘要 本发明提供一种含有人PD1基因sgRNA的T细 胞， 所述sgRNA是敲除PD1基因的靶 点； 所述sgRNA 的核苷酸序列为序列表中SEQ  ID NO： 4、 SEQ  ID  NO： 6或SEQ  ID NO： 8所示； 将含有sgRNA的质粒转 染到T细胞中， 得到含sgRNA的Crispr ‑PD1‑T细 胞； 本发明所述含sgRNA的Crispr ‑PD1‑T细胞对 PD1基因的敲除率为58.26 ‑72.67%； 对结肠癌细 胞系LoVo和宫颈癌HELA细胞系表现出显著的特 异性细胞毒性作用并呈现效靶比梯度依赖性即 效靶比越高细胞毒性作用越强。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图3页 CN 114032213 A 2022.02.11 CN 114032213 A 1.一种含有人PD1基因sgRNA的T细胞， 其特征在于： 所述sgRNA是敲除PD1基因的靶点； 所述sgRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ  ID NO： 4、 SEQ  ID NO： 6或SEQ  ID NO： 8所示； 将含 有sgRNA的质粒转染到T细胞中， 得到含sgRNA的Crispr ‑PD1‑T细胞。 2.根据权利要求1所述的T细胞， 其特 征在于： 所述Crispr ‑PD1‑T细胞的制备 方法如下： 步骤1、 采集患 者外周血， 分离出单个核细胞， 将收集的单个核细胞用生理盐水清洗后， 得到T细胞； 收集的血浆经灭活、 离心后， 取 上清， 得到血浆上清； 步骤2、 将 T细胞加入KBM551培养基重悬细胞， 使细胞密度保持在1 ×106个/mL， 添加γ干 扰素浓度为20 0 IU/mL， 放入培 养箱培养； 步骤3、 γ干扰素作用24h后， 添加CD3/CD28 单抗和IL ‑2， 浓度分别为50ng/mL和300  IU/ mL， 培养48h后得到活化的T细胞； 步骤4、 在6孔板中加入2mL/孔新鲜的含有300  IU/mL IL‑2的KBM551培养基， 置于37℃ 培养箱中预热， 得到预热 的培养基； 收集活化的T细胞， 取1.5 ×107个细胞， 用0.3mL电转液 重悬， 加入6 μg含有sgRNA的质粒混合均匀， 选择电活化T细胞程序电转， 电转完成后将细胞 立即转移至预 热的培养基中， 放回37℃培 养箱中继续培 养； 步骤5、 48h后， 取细胞进行流式检测， 检测电转的效率； 取样计数， 根据计数结果补充相 应的免疫细胞培养基和IL ‑2， 使细胞的浓度维持在1 ×106个/mL， IL ‑2的浓度维持在300IU/ mL， 添加5Vo l%的血浆上清； 步骤6、 48h后进行细 胞计数， 根据计数结果补充相应的免疫细 胞培养基和IL ‑2， 使细胞 的浓度维持在1 ×106个/mL， IL‑2的浓度维持在3 00IU/mL， 补加5Vo l%的血浆上清； 步骤7、 48h后收集细胞， 得到 Crispr‑PD1‑T细胞。 3.如权利要求1所述的含有人PD1基因sgRNA的T细胞的应用， 其特征在于： 所述含有人 PD1基因sgRNA的T细胞在治疗抗肿瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114032213 A 2一种含有人PD1基因sgRNA的T细胞及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种含有人P D1基因sgRNA的T细胞及其应用， 属于基因工程 技术领域。 背景技术 [0002]PD‑1(程序性死亡受体1， programmed  death 1) 蛋白属于免疫球蛋白超家族成 员， 可表达于活化的T细胞、 B细胞和骨髓细胞， 以及CD4‑CD8‑胸腺细胞。 PD ‑1有两个配体， 即 PD‑L1 （B7‑H1） 和PD‑L2 （B7‑DC） ， 均为B7家族中的新成员。 PD ‑1是免疫抑制性受体， 与其配体 PD‑L1、 PD‑L2相互作用传递抑制性信号， 在免疫应答中发挥负向调控作用。 T细胞上的PD ‑1 与肿瘤细胞中的PD ‑L1/ PD‑L2的结合， 可抑制活化的T细胞攻击肿瘤细胞， 导致免疫系统不 能发挥全部作用， 使肿瘤 细胞逃逸。 [0003]Crispr/Cas9技术是非常热门的基因编辑操作工具， 目前华西医院已报道利用 Crispr技术敲除T细胞中的PD1， 具有安全 无副作用的优势。 目前用于设计sgRNA的网站有十 多个， 同一个基因设计出来的sgRNA序列多达数百个， 其每个sgRNA导入细胞内后造成的敲 除效率是不同的， 需要筛 选出敲除效率高的sgRNA。 [0004]CN103820454B专利虽然提供了180个PD1的sgRNA序列， 但只给出了其中4个单 sgRNA和4个双sgRNA的效果， 对于其余sgRNA并没有验证其敲除效率。 CN107586777A专利虽 然也提供了131个sgRNA， 但对于其效果只提供了sgRNA活性， 没有涉及具体的敲除效率。 [0005]CN10567108 3B专利仅公开了一个sgRNA序列的效果， 其余sgRNA序列具有的敲除效 率是未知的。 发明内容 [0006]针对现有技术存在的不足， 本 发明提供一种含有人PD1基因s gRNA的T细胞， 实现以 下发明目的： 筛选出高敲除率的sgRNA， 提高T细胞对肿瘤 细胞的杀伤力。 [0007]为解决上述 技术问题， 本发明采取以下技 术方案： 一种含有人PD1基因sgRNA的T细胞， 所述sgRNA是敲除PD1基因的靶点； 所述sgRNA 的核苷酸序列为序列表中SEQ  ID NO： 4、 SEQ  ID NO： 6或SEQ  ID NO： 8所示； 将含有sgRNA的 质粒转染到T细胞中， 得到含sgRNA的Crispr ‑PD1‑T细胞。 [0008]以下是对上述 技术方案的进一 步改进： 所述Crispr ‑PD1‑T细胞的制备 方法如下： 步骤1、 采集结肠癌患者外周血， 分离出单个核细胞， 将收集的单个核细胞用生理 盐水清洗后， 得到T细胞； 收集的血浆经灭活、 离心后， 取 上清， 得到血浆上清。 [0009]步骤2、 将T细胞加入KBM551培养基重悬细胞， 使细胞密度保持在1 ×106个/mL， 添 加γ干扰素浓度为20 0 IU/mL， 放入培 养箱培养。 [0010]步骤3、 γ干扰素作用2 4h后， 添加CD 3/CD28单抗和IL ‑2， 浓度分别为50ng/mL和300   IU/mL， 培 养48h后得到活化的T细胞。说　明　书 1/10 页 3 CN 114032213 A 3