(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111419541.4 (22)申请日 2021.11.26 (71)申请人 杭州乾合细胞生物科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市江干区同协路 1279号西子智慧产业园17号 (72)发明人 陈伟　刘昊　胡立强　谢尚志　 (74)专利代理 机构 宁波理文知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 33244 代理人 孟湘明 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种含有靶向Her-2 CAR序列的核 酸构建体 及其应用 (57)摘要 一种含有靶向Her ‑2 CAR序列的核 酸构建体 及其应用， 所述核酸构建体是由肿瘤相关抗原结 合区、 胞外铰链区、 跨膜结构域以及细胞内信号 传导结构域串联组成， 所述肿瘤相关抗原结合区 为靶向Her ‑2的单链抗体 FRP5 scFv， 其核酸和多 肽序列分别如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示。 所述核酸构建体可用于 特异性识别表达Her ‑2高 表达的肿瘤细胞， 激活免疫细胞， 使其释放IFN ‑ γ等细胞因子杀伤肿瘤细胞。 权利要求书2页 说明书12页 序列表12页 附图5页 CN 114106203 A 2022.03.01 CN 114106203 A 1.一种含有靶向Her ‑2 CAR序列的核酸构 建体， 其特征在于， 所述核酸构 建体是由肿瘤 相关抗原结合区、 胞外铰链区、 跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域串联 组成， 所述肿瘤 相关抗原结合区为靶向Her ‑2的单链抗体FRP5  scFv， 其核酸和多肽序列分别如SEQ  ID  NO.3和SEQ  ID NO.4所示。 2.如权利权利要求1所述的核酸构建体， 其特征在于， 所述核酸构建体还包含信号肽， 所述信号肽 可选自Human  IgKVIII、 Mouse  Ig Kappa、 Human  IL‑2、 Human insulin、 CD8a的 信号肽。 3.如权利权利要求2所述的核酸构建体， 其特征在于， 所述CD8a信号肽的核酸及多肽序 列分别如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示。 4.如权利权利要求1 ‑3任一项所述的核酸构建体， 其特征在于， 所述胞外铰链区的可选 自CD8、 CD28、 CTLA4、 P D‑1、 NKG2D、 IgG1、 含或不含C H2‑CH3区域的IgG4的铰链区序列。 5.如权利权利要求4所述的核酸构 建体， 其特征在于， 所述CD8胞外铰链区、 CD28胞外铰 链区以及IgG4  Hinge‑CH2‑CH3胞外铰链区的核 酸及多肽序列分别如SEQ  ID NO.5和SEQ  ID  NO.6所示， SEQ  ID NO.7和SEQ  ID NO.8所示， SEQ  ID NO.9和SEQ  ID NO.10所示。 6.如权利权利要求1 ‑3任一项所述所述的核酸构建体， 其特征在于， 所述跨膜结构域可 来源于下列蛋白质跨膜结构域的核酸、 多肽序列： T细胞受体的α、 β 或ζ链， CD28， CD3 ε， CD45， CD4， CD5， CD8， CD9， CD16， CD22， CD33， CD37， CD64， CD80， CD86， CD134， CD137， CD154， DAP10， DAP12， NKG2 A， NKG2D， P D‑1， CTLA。 7.如权利权利要求6所述的核酸构 建体， 其特征在于， 所述CD8跨膜结构域、 CD28跨膜结 构域、 以及NKG2D跨膜结构域的核酸及多肽序列分别如SEQ  ID NO.11和SEQ  ID NO.12所示， SEQ ID NO.13和SEQ  ID NO.14所示， SEQ  ID NO.15和SEQ  ID NO.16所示。 8.如权利权利要求1 ‑3任一项所述的核酸构建体， 其特征在于， 所述细胞内信号传导结 构域包含或不包含共刺激结构域， 所述共刺激结构域可来源于下列蛋白质胞内功能性信号 传导结域的核 酸、 多肽序列中的一个或多个不同组合： OX40， CD27， CD28， CDS， ICA M‑1， LFA‑1 (CD11a/CD18)， ICOS(CD278)， DAP10， DAP12， 4 ‑1BB(CD137)和2B4或其功能性变 体。 9.如权利权利 要求8所述的核酸构 建体， 其特征在于， CD137共刺激结构域、 CD28共刺激 结构域、 DAP10共刺激结构域、 以及2B4共刺激结构域的核酸及多肽序列分别如SEQ  ID  NO.17和SEQ  ID NO.18所示， SEQ  ID NO.19和SEQ  ID NO.20所示， SEQ  ID NO.21和SEQ  ID  NO.22所示， SEQ  ID NO.23和SEQ  ID NO.24所示。 10.如权利权利要求1 ‑3任一项所述的核酸构建体， 其特征在于， 所述信号转导结构域 通常为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体Fc εRIγ链， 含有免疫受体酪氨 酸活化基 序。 11.如权利权利要求10所述的核酸构建体， 其特征在于， 所述信号转导结构域为CD3ζ Signaling Domain， 其核酸及多肽序列分别如SEQ  ID NO.25和SEQ  ID NO.26所示。 12.一种含有靶向Her ‑2 CAR序列的核酸构建体， 其特征在于， 所述核酸构建体是由信 号肽、 肿瘤相关抗原结合区、 胞外铰链区、 跨膜结构域以及包含共刺激结构域的细胞内信号 传导结构域串联组成， 核酸构建体中的各部件的核酸及多肽序列如权利要求1 ‑11所述， 所 述含有靶向Her ‑2 CAR序列的核酸构建体可选自a) ‑g)的任一组或其组合， 各组合分别如 下：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114106203 A 2a)CD8 SP‑Her‑2scFv(FRP5) ‑CD8 H‑CD8 TMD‑CD137 CD‑CD3ζSD； b)CD8 SP‑Her‑2scFv(FRP5) ‑CD8 H‑CD28 TMD‑CD28 CD‑CD3ζSD； c)CD8 SP‑Her‑2scFv(FRP5) ‑CD8 H‑CD28 TMD‑CD28 CD‑CD137 CD‑CD3ζSD； d)CD8 SP‑Her‑2scFv(FRP5) ‑CD8 H‑CD28 TMD‑CD28 CD‑DAP10 CD‑CD3ζSD； e)CD8 SP‑Her‑2scFv(FRP5) ‑CD8 H‑NKG2D TMD‑2B4 CD‑CD3ζSD； f)CD8 SP‑Her‑2scFv(FRP5) ‑CD8 H‑NKG2D TMD‑2B4 CD‑DAP10 CD‑CD3ζSD； g)CD8 SP‑Her‑2scFv(FRP5) ‑CD8 H‑NKG2D TMD‑CD137 CD‑2B4 CD‑CD3ζSD。 13.如权利权利要求12所述的核酸构 建体， 其特征在于， 所述核酸构 建体选自e)CD8SP ‑ Her‑2scFv(FRP5) ‑CD8 H‑NKG2D TMD‑2B4 CD‑CD3ζSD； 其核酸序列如SEQ  ID NO.29所示。 14.一种包含权利要求1 ‑13任一项所述的含有靶向Her ‑2 CAR序列的核酸构建体的慢 病毒载体， 其特 征在于， 所述慢病毒载体包 含穿梭质粒、 包膜质粒和包 装质粒。 15.如权利权利要求14所述的慢病毒载体， 其特征在于， 所述穿梭质粒是以pCDH ‑UBC‑ DSRED‑LUC‑EF1 Hygro为起始载体， 并构建含有EFS启动子， 所述启动子用于启动外源基因 表达的慢病毒载体。 16.如权利权利 要求14所述的慢病毒载体， 其特征在于， 所述包膜质粒是以pMD2.G为起 始载体， 并构建含有BaEVRless片段的载体， 其中BaEVRless片段的核酸序列如SEQ  ID  NO.28所示。 17.权利要求1‑13任一项所述的核酸构建体， 或权利要求14 ‑16任一项所述的慢病毒载 体在制备用于治疗或杀伤肿瘤 细胞或用于治疗癌症患者的药物中的用途。 18.权利要求17所述的用途， 其特征在于， 用于所述核酸构建体导入的免疫 效应细胞可 以是T细胞、 NK细胞或巨噬细胞， 并且而其来源 可以是自体的、 同种异体、 干细胞分化或特定 细胞系。 19.如权利要求18所述的用途， 其特 征在于， 所述免疫效应细胞为 NK细胞。 20.如权利要求17 ‑19任一项所述的用途， 其特征在于， 所述肿瘤细胞或所述患者为 Her‑2阳性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114106203 A 3