(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111415733.8 (22)申请日 2021.11.25 (71)申请人 广西医科 大学 地址 530021 广西壮 族自治区南宁市双拥 路22号 (72)发明人 卢小玲　杨晓梅　李海霞　姜晓兵　 孙树扬　 (74)专利代理 机构 北京格允知识产权代理有限 公司 11609 代理人 谭辉 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/867(2006.01)A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种基于纳米抗体靶向EGFRvIII的嵌合抗 原受体T细胞的制备方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种基于纳米抗体靶向EGFRv Ⅲ 的嵌合抗原受体、 表达该受体的CAR ‑T细胞及其 制备方法和应用。 所述嵌合抗原受体包含： 胞外 抗原识别区EGFRv ⅢVHH、 铰链区CD8、 跨膜区CD8、 胞内共刺激域CD13 7和胞内信号转导域CD3ζ。 本 发明还涉及编码所述嵌合抗原受体核苷酸序列， 表达所述嵌合抗原受体的CAR ‑T细胞及其制备方 法和应用以及包含所述CAR ‑T细胞的药物组合 物。 本发明的CAR ‑T细胞在对EGF RvⅢ阳性肿瘤细 胞具有较好的杀伤作用， 为肿瘤的过继性免疫治 疗提供了新策略。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图6页 CN 114106201 A 2022.03.01 CN 114106201 A 1.一种嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述嵌合抗原受体包含： 胞外抗原识别区EGFRv Ⅲ VHH、 铰链区CD 8、 跨膜区CD 8、 胞内共刺激域CD137和胞内信号 转导域CD3ζ 。 2.根据权利要求1所述的嵌合 抗原受体， 其特 征在于： 所述嵌合抗原受体包含依次串联的胞外抗原识别区EGFRv ⅢVHH、 铰链区CD8、 跨膜区 CD8、 胞内共刺激域CD137和胞内信号 转导域CD3ζ 。 3.根据权利要求1或2所述的嵌合 抗原受体， 其特 征在于： 所述嵌合抗原受体在N末端还包含第一标签蛋白flag  tag1； 和/或所述嵌合抗原受体 在C末端还包含第二标签蛋 白flag tag2， 其中所述第一标签蛋 白Flag‑tag1与所述第二标 签蛋白fla g tag2的序列相同或不同； 优选的是， 所述嵌合 抗原受体在N末端还 包括信号肽； 另外优选的是， 所述嵌合抗原受体在胞外抗原识别区EGFRv ⅢVHH的N末端包含第一柔 性肽序列； 和/或所述嵌合 抗原受体在胞内信号 转导域CD3ζ 的C末端包 含第二柔性肽序列。 4.根据权利要求1至 3中任一项所述的嵌合 抗原受体， 其特 征在于： 所述嵌合 抗原受体由包 含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码； 优选的是， 所述嵌合 抗原受体由SEQ  ID NO.1所示的核苷酸序列编码。 5.一种编码嵌合 抗原受体的核苷酸序列， 其特 征在于： 所述嵌合 抗原受体如权利要求1至4中任一项所述； 优选的是， 所述核苷酸序列包 含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 更优选的是， 所述核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 6.一种纳米抗体靶向EGFRv Ⅲ的CAR‑T细胞， 其特 征在于： 所述CAR‑T细胞表达如权利要求1至4中任一项所述的嵌合 抗原受体。 7.一种如权利要求6所述的CAR ‑T细胞的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步 骤： (1)获取权利要求5所述的核苷酸序列； (2)将所述核苷酸序列重组到慢病毒质粒载体例如GV538慢病毒质粒载体中， 得到重组 慢病毒质粒； (3)使用所述重组慢病毒载体通过三质粒系统包装慢病毒， 得到包含所述核苷酸序列 的重组慢病毒； 优选的是， 采用三质粒系统， 将所述重组慢病毒质粒载体通过两个作为辅助 载体质粒的Helper  1.0和Helper  2.0共转染2 93T细胞， 获得重组慢病毒； (4)利用重组慢病毒转染T细胞， 从而得到所述CAR ‑T细胞。 8.一种如权利 要求5所述的纳米抗体靶向EGFRv Ⅲ的CAR‑T细胞或权利 要求6或7所述方 法制得的纳米抗体靶向EGFRv Ⅲ的CAR‑T细胞在制备治疗肿瘤制剂中的应用。 9.如权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 所述肿瘤是EGFRv Ⅲ阳性肿瘤。 10.一种药物组合物， 所述药物组合物包含如权利要求5所述的纳米抗体靶向EGFRv Ⅲ 的CAR‑T细胞或权利要求6或7所述方法制得的纳米抗体靶向EGFRv Ⅲ的CAR‑T细胞和药学上 可接受的载体。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114106201 A 2一种基于纳米抗体靶向EGFRvI II的嵌合抗原受体T细胞的制 备方法及其应用 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤生物制品领域， 尤其涉及过继免疫治疗中的靶向EGFRv Ⅲ的嵌合 抗原受体， 表达该受体的CAR ‑T细胞(EGFRv ⅢNb CAR‑T细胞)及其制备 方法及其应用。 背景技术 [0002]T细胞可以通过表达嵌合抗原受体(Chimeric  antigen receptor,CAR)来靶向肿 瘤细胞。 CAR通过将可以特异 性识别肿瘤抗原的单链 抗体与可活化T细胞的受体胞内结构域 “免疫受体酪氨 酸活化基序 ”用人工方法融合 成重组基因来制备。  CAR‑T细胞疗法是目前肿 瘤免疫治疗的当下最热门最有研究价值的治疗方法。 目前CAR ‑T治疗在血液肿瘤中取得了 很好的进展， 但是由于实体肿 瘤微环境复杂， CAR ‑T对实体瘤的杀伤效果有限， 因此需要探 索新的方法来 提高CAR‑T治疗实体肿瘤的活性。 [0003]CAR的基础设计中包括肿瘤相关抗原结合区、 胞内信号区、 跨膜区、 胞外铰链区等。 CAR‑T目前已经发展到第五代， 在血液肿瘤中取得了很好的进展， 而对于实体瘤 治疗， CAR ‑T 细胞疗法的效果一直不佳， 其中重要原因是肿瘤特异性T细胞难以突破肿瘤微环境的免疫 抑制作用。 除此之外， 目前大多 数CAR 识别抗原的部 分是由单链 抗体组成的， 由于不同的单 链抗体的VL和VH之间会出现错配， 使 得表达出来的单链 抗体亲和力下降， 也是造成CAR ‑T治 疗效果不佳的原因。 因此需要探索新的方法来提高CAR ‑T治疗实体肿瘤的活性， 进一步研究 构建既能特异性识别肿瘤抗原并且产生高效抗癌作用的EGFRv ⅢNb CAR‑T细胞。 [0004]纳米抗体是目前最小的功能性抗原特异性结合天然片段， 由约为120个氨基酸组 成， 长度4nm， 直径2.5nm。 相对于传统的单克隆抗体以及Fab 片段(55×103) 或者scFv(28 × 103)， 纳米抗体的分子量更小， 因此具有更强、 更快的组织透过能力， 能够到达实体瘤等致 密组织发挥作用。 除此之外， 纳米抗体稳定性好， 亲和力较高、 免疫原 性弱、 易于进 行基因改 造， 不会出现传统抗体容易产生错误配对以及需要优化重链和轻链连接序列问题等优点， 在肿瘤免疫 治疗等方面展现了广阔的应用前 景。 [0005]表皮生长因子受体III型突变体(epidermal  growth factor receptor  variant  III， EGFRvIII)是表皮生长因子受体最常见的突变体， 由外显子2到7的框内缺失和外显子 1和8的连接处产生新的甘氨酸残基引起的。 这种新的氨基酸在E GFR胞外区产生了肿瘤特异 性、 致癌性和免疫原性的表位。 EGFRvIII具有较好的肿瘤特异性， 仅在胶质母细胞瘤 (glioblastoma,GBM)和其他肿瘤细胞表面表达， 在正常组织中不存在。 在新诊断的GBM病例 中， EGFRvIII表达率约为30％， 是治疗胶质母细胞瘤(GBM)的理想靶点。 EGFRv Ⅲ在肿瘤中的 表达往往与不良预后相关， 靶向EGFRv Ⅲ的抗体药物对于抑制GBM的进展和侵袭具有很大的 治疗价值。 发明内容 [0006]为了解决现有技术中CAR ‑T细胞疗法的效果一直不佳的问题， 本发明在第一方面说　明　书 1/8 页 3 CN 114106201 A 3