(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111410482.4 (22)申请日 2021.11.19 (71)申请人 广东工业大 学 地址 510090 广东省广州市越秀区东 风东 路729号 (72)发明人 袁正强　袁倩　苏奎　黎淑怡　 孙健武　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 赵崇杨 (51)Int.Cl. A61K 38/17(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/46(2006.01)A61K 45/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 15/12(2006.01) (54)发明名称 一种复合共载送小分子核酸和活性蛋白的 外泌体纳米粒子及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种复合共载送小分子核酸 和活性蛋白的外泌体纳米粒子及其制备方法和 应用。 所述纳米粒子包括来自细胞并载入了活性 蛋白的复合外泌体， 以及装 载在复合外泌体内的 小分子核酸。 本发明先经过基因工程修饰构建慢 病毒载体， 通过慢病毒转染将活性蛋白的目的基 因整合到细胞上， 得到载入了活性蛋白的复合外 泌体， 再载入治疗核 酸siRNA， 实现外泌体共载送 siRNA和活性蛋白。 本发明表明， 靶向凋亡抑制基 因的siRNA和活性蛋白具有复合协同作用， 能高 效特异地杀死耐药性癌细胞， 并且与抗肿瘤药物 组合使用， 能进一步提高治疗效果， 可实现药物 基于外泌体对耐药性癌症的多靶点联合精准治 疗， 为癌症治 疗提供更多更高效的药物。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 114191539 A 2022.03.18 CN 114191539 A 1.一种复合载送小分子核酸和协同活性蛋白的外泌体纳米粒子， 其特征在于， 包括来 自细胞并载入了活性蛋白的复合外泌体， 以及装载在复合外泌体内的小分子核酸。 2.根据权利要求1所述的纳米粒子， 其特征在于， 所述细胞包括间充质干细胞、 骨髓干 细胞、 胚胎干细胞、 脐带干细胞、 肿瘤 细胞、 肿瘤干细胞、 免疫细胞或 成纤维细胞中的一种。 3.根据权利要求1所述的纳米粒子， 其特 征在于， 所述活性蛋白为TRAI L蛋白。 4.根据权利要求1所述的纳米粒子， 其特征在于， 所述小分子核酸为siRNA ‑CDK9和/或 siRNA‑eif5B。 5.权利要求1所述纳米粒子的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.基因工程修饰构建慢病毒载体， 通过慢病毒转染将活性蛋白的目的基因整合到细 胞上， 在培养箱中培 养， 提取外泌体， 即得到载入了活性蛋白的复合外泌体； S2.将步骤S1中得到的载入了活性 蛋白的复合外泌体， 进行重悬后与小分子核酸混合， 冰上超声处 理， 摇床孵 育， 得到复合载送小分子核酸和活性蛋白的外泌体纳米粒子 。 6.根据权利要求5所述制备方法， 其特征在于， 所述步骤S1中基因工程修饰包括慢病 毒 转染、 逆转录病毒转染或腺病毒转染中的一种。 7.根据权利要求5或6所述制备方法， 其特征在于， 所述步骤S2中载入了活性蛋白的复 合外泌体与小分子核酸混合的体积比为3～8 :1。 8.权利要求1 ‑4任一所述复合载送小分子核酸和 协同活性蛋白的纳米粒子在制备抗肿 瘤药物中的应用。 9.一种抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 含有上述权利要求1 ‑4任一所述复合载送小分 子核酸和协同活性蛋白的纳米粒子和抗肿瘤药物。 10.根据权利要求9所述组合物， 其特征在于， 所述抗肿瘤药物包括化疗药物、 免疫治疗 药物、 重构肿瘤微环境的药物中的至少一种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114191539 A 2一种复合 共载送小分子核酸和活性蛋白的外泌体纳米粒子及 其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于纳米载药与肿瘤学技术领域， 更具体地， 涉及一种复合共载送小分子 核酸和活性蛋白的外泌体纳米粒子及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]肿瘤的耐药性是造成肿瘤难以治愈 的主要原因， 研究表明， 肿瘤的复发与转移与 耐药性肿瘤干细胞(cancer  stem cells， CSCs)具有密切的联系。 而CSCs的耐药性主要包括 以下两个方面： 获得性耐药性和天然耐药性。 获得性耐药是指长期暴露于辐 射或致癌因子 后， CSCs和相近的子代细胞可通过与正常干细胞积累突变的同样机制(点突变、 基因激活、 基因扩增)等出现新的耐药性； 天然耐药性指处于静止期的CSCs具有DNA自我修复能力和 APC转运蛋白而获得的与生俱来的耐药性。 而细胞周期蛋白依赖性激酶9(cyclin   dependent  kinase9， CDK9)是一种DNA转录调节因子， 与细胞凋亡调 控有密切的关系。 有研 究表明， 抑制CDK9可以重新激活在表观遗传上被癌症沉默的基因， 同时调节凋亡抑制基因 的表达， 解除癌细胞的凋亡耐药性， 致敏其对治疗药物的应答。 因此， CDK9是一种潜在的癌 症治疗分子靶位。 [0003]外泌体是细胞分泌的粒径在30 ‑150nm的细胞外囊泡， 外被磷脂双分子层结构， 能 够透过体内的天然屏障(如血脑屏障)， 具有良好的肿瘤 靶向性。 此外， 外泌体在机体内部还 具有良好的生物稳定性和生物相容性、 低免疫原性和低毒性。 外泌体不仅具有细胞间信息 传递的作用， 还作为一种天然的生物纳米载体， 被开 发运用于各类 分子(包括si RNA)的细胞 间传输。 与传统的药物载体相比， 外泌体作为一种新型的， 天然药物载体， 显示诸如生物相 容性好、 免疫原性低， 良好的肿瘤靶向性 等优点。 [0004]小分子干扰核酸(small  interfering  RNA， siRNA)是一类通常长度为20 ‑25个核 苷酸的双链RNA， 它进入体内后通过干扰mRNA影响翻译过程， 从而沉默该基因的蛋白合成。 目前已经有研究表明小干扰核酸疗法Inclisiran作为首创的降低低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoprotein  cholesterol， LDL ‑C)的siRNA疗法在欧洲获批用于治疗成人 高胆固醇血症及混合性血脂异常， 这将是引领慢性疾病治疗的一个全新的革命。 但由于 siRNA自身结构的不稳定性， 在体内实验中通常需要对其进 行化学修饰， 这些化学修饰可能 会改变siRNA的性质甚至影响其基因沉默 的效果， 且siRNA是无法自主进入细胞的， 因此寻 求一种行之有效的递载siRNA的方法就成为必要。 [0005]目前， 已有研究采用外泌体运载siRNA。 如现有技术公开了一种复合siRNA纳米载 体， 是一种以自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜包裹载送si RNA和血清白蛋白的复合纳米， 应用于抗肿瘤。 但是， 该技术使用外泌体载送的siRNA和血清白蛋白两种分子只是复合载 送， 两者并无协同治疗效应。 为了更好地应用外泌体作为 天然药物载体提高治疗效果， 寻找 一种有效的装载siRNA并联合其他药物用于癌症协同治疗的新策 略， 对于开发高效的癌症 精准治疗纳米药物有巨大的实际应用价 值。说　明　书 1/5 页 3 CN 114191539 A 3