(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111323503.9 (22)申请日 2021.11.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113912726 A (43)申请公布日 2022.01.11 (73)专利权人 深圳市国创纳米抗体技 术有限公 司 地址 518110 广东省深圳市龙华区观澜街 道新澜社区观 光路1301号银星 科技大 厦C803 (72)发明人 宋海鹏　刘原源　于建立　王准　 曹慧　古一　李飞　张霞　蒋立仲　 宋亮　(74)专利代理 机构 北京市众天律师事务所 11478 专利代理师 李新军 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C07K 16/46(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) 审查员 袁一方 (54)发明名称 一种抗CD16和C EA抗原的双特异性 抗体 (57)摘要 本发明公开了一种抗CD16抗原的纳米抗体， 以及含有两种VHH结构域的双特异性抗体。 所述 抗CD16抗原的纳米抗体具有独特的3个互补决定 区CDR1、 CDR2、 CDR3。 所述双特异性抗体由两条不 同序列的重链融合而成， 分别识别NK细胞表面的 CD16抗原和癌胚抗原CEA。 且该双特异性抗体能 够显著增强抗体介导的NK细胞杀伤肿瘤靶细胞 的活性。 权利要求书1页 说明书9页 序列表5页 附图6页 CN 113912726 B 2022.12.06 CN 113912726 B 1.一种抗NK细胞表面抗原CD16的纳米抗体， 其特征在于， 所述纳米抗体的可变区具有3 个互补决定区CDR1、 CDR2、 CD R3， 其中， CDR1序列由SEQ  ID NO.1所述氨基酸序列组成， CDR2 序列由SEQ  ID NO.2所述氨基酸序列组成， CDR3序列由SEQ  ID NO.3所述氨基酸序列组成。 2.根据权利 要求1所述的纳米抗体， 其特征在于， 所述纳米抗体的可变区序列由SEQ  ID  NO.4所述氨基酸序列组成。 3.一种编码权利要求2所述纳米抗体序列的核酸， 其特征在于， 所述核酸的序列由SEQ   ID NO.5所示。 4.一种含有权利要求3所述的核酸的表达载体， 其特 征在于， 所述载体为pM ES4。 5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞， 其特征在于， 所述细胞为大肠杆菌 BL21 （DE3） 。 6.一种双特异性抗体， 其特征在于， 所述抗体含有第 一重链和第 二重链， 所述第 一重链 的可变区识别CD16抗原， 其可变区序列由SEQ  ID NO.4所述氨基酸序列组成； 所述第二重链 的可变区识别C EA抗原， 其可变区序列由SEQ  ID NO.6所述氨基酸序列组成。 7.根据权利要求6所述的双特异性抗体， 其特征在于， 所述第 一重链和第 二重链之间设 有连接肽， 所述连接肽为 （G4S）n， 其中n为1‑6之间的整数。 8.根据权利要求7所述的双特异性抗体， 其特征在于， 所述n=4， 所述双特异性抗体的氨 基酸序列如SEQ  ID NO.7所示。 9.一种编码权利要求8所述双特异性 抗体的核酸， 所述序列由SEQ  ID NO.9所示。 10.根据权利要求8所述的双特异性抗体， 其特征在于， 在所述双特异性抗体的羧基端 还带有抗体恒定区， 其恒定区序列如SEQ  ID NO.8所述的氨基酸序列所示。 11.一种编码权利要求10所述双特异性 抗体的核酸， 所述序列由SEQ  ID NO.10所示。 12.一种含有权利 要求11所述核酸的表达载体， 其特征在于， 所述载体为p FUSE hIgG1‑ Fc2。 13.一种含有权利要求12所述表达载体的宿主细胞， 其特征在于， 所述宿主细胞为 HEK293细胞。 14.权利要求1或2所述的抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。 15.权利要求6 ‑8， 10任一所述的抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113912726 B 2一种抗CD16和CEA抗原的双特异性抗体 技术领域 [0001]本发明公开了一种多肽， 更 具体地， 公开了一种抗体， 属于免疫学 领域。 背景技术 [0002]癌胚抗原(CEA， 又称为CEACAM ‑5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。 CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员， 并且含有 经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接 的7个域。 7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1 ‑B1‑A2‑B2‑A3‑B3)。 CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质， 现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。 CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到， 包括结肠直肠癌、 胰腺癌、 肺癌、 胃癌、 肝细胞 瘤、 乳腺癌和甲状腺癌。 因此， CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。 CEA容易自细胞表面切割， 并 直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。 由于此特性， 已经使用血清CEA的水平作为临床 标志物以诊断癌症并筛选癌症。 而且， CEA也已被用作肿瘤标记， 测量癌症患者血液中升高 的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。 [0003]更重要的是， CEA已成为用于靶向治疗的肿瘤相关抗原。 已经报道的使用CEA靶 向 免疫治疗癌症主要有2种 方法。 一种 方法是使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性， 特别 是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)， 以消除表达CEA的肿瘤细 胞。 另一种方法是通过抗CEA 抗体或抗体片段与药物、 毒 素、 放射性核苷 酸、 免疫调节剂或细 胞因子等效应分子缀合， 特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞， 从而发挥效应分子的治疗作用。 我们都知道， 自然杀伤细胞(natural  killer， NK  cells)是机体具有细胞毒性的免疫细胞 之一， 表达CD 56和CD16， 在肿瘤的免疫治疗中发挥 抗肿瘤效应。 NK细胞可以在未致敏的情况 下， 具有很强的杀伤肿瘤细胞和病毒感染性细胞的活性。 一个NK细胞可以裂解体积超过其 几倍的肿瘤细胞。 最近的研究表明， 与活化的T淋巴细胞不同， NK细胞更倾向于杀伤肿瘤干 细胞[Ames  E， Canter  RJ， Grossenbacher  SK， et al.NK cells preferentially  target  tumor cells with a cancer stem cell phenotype.The  Journal of Immunology， 2015, 195(8):4010 ‑4019]。 NK细胞在肿瘤的免疫治疗中发挥抗肿瘤效应的重要机制之一就是 ADCC作用。 而CD16分子就是NK细胞启动ADCC效应过程中不可或缺的条件， 在许多基于抗 CD16抗体的肿瘤 治疗中， 由于只能特异 性连接一个抗原靶点， 其特异 性相对较低， 易产生脱 靶效应。 [0004]双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术， 可以同时识别2种不同的抗原。 利用双特异性抗体， 可以研发同时针对肿瘤细胞和NK细胞的双特异性抗体， 在识别肿瘤细 胞抗原， 中和肿瘤细胞标志物从而阻断其诱导肿瘤细胞增殖等效应的同时， 识别免疫细胞， 将免疫细胞引导到肿瘤细胞的附近， 加强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用， 如CEA 抗原和NK 细胞的CD16抗原。 [0005]1993年， Hamers ‑Casterman等研究发现， 在骆驼科动物(骆驼、 单峰骆驼和美洲驼) 的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体， 其主要是IgG2和IgG3类型， 此类抗体由于 缺乏轻链， 于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy  chain only like Antibody，说　明　书 1/9 页 3 CN 113912726 B 3