(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111348993.8 (22)申请日 2021.11.15 (71)申请人 南京鼓楼医院 地址 215506 江苏省南京市 鼓楼区中山 东 路321号 (72)发明人 李稀罕　邹晓平　 (74)专利代理 机构 南京天翼专利代理有限责任 公司 321 12 代理人 贾曼曼 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/861(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/34(2006.01)A61K 35/761(2015.01) A61K 41/00(2020.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种溶瘤腺病毒、 其构建方法及其应用 (57)摘要 本发明提供一种溶瘤腺病毒、 其构建方法及 其应用， 本发明的溶瘤腺病毒可联合PDT杀伤肿 瘤细胞。 本发明提供一种溶瘤腺病毒， 其以 pAdEasy‑1腺病毒为基础,插入有E1A、 CAT基因和 蛋白质光敏剂基因。 本发明在溶瘤腺病毒本身裂 解肿瘤细胞的同时， 通过病毒表达的过氧化氢酶 降解肿瘤组织中过量表达的过氧化氢而产氧， 从 而为病毒表达的蛋白质光敏剂提供氧源， 联合杀 伤肿瘤细胞， 大幅提高肿瘤细胞杀伤效果。 权利要求书1页 说明书5页 序列表15页 附图4页 CN 114164186 A 2022.03.11 CN 114164186 A 1.一种溶瘤腺病毒， 其特征在于， 其以pAdEasy ‑1腺病毒为基础,插入有E1A、 CAT基因和 蛋白质光敏剂基因。 2.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒， 其特 征在于， E1A的3端插 入有miRNA靶序列。 3.根据权利要求2所述的溶瘤腺病毒， 其特征在于， 所述miRNA靶序列为两种或者多种 miRNA靶序列的组合。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的溶瘤 腺病毒， 其特征在于， 所述蛋白质光敏剂基因为 KillerRed基因。 5.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒， 其特征在于， E1A、 CAT基因和所述蛋白质光敏剂 基因的两端分别插 入了CMV启动子和po lyA尾。 6.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒， 其特征在于， E1A、 CAT基因和所述蛋白质光敏剂 基因依次插 入pAdEasy ‑1腺病毒。 7.根据权利要求2 ‑6任一项所述溶瘤腺病毒的构建方法， 包括： （1）在穿梭质粒 pAdTrack ‑CMV多克隆位点插入E1A、 CAT基因和蛋白质光敏剂基因， 所述E1A的3端插入有 miRNA靶序列； （2） 将步骤1得到的重组穿梭制粒和骨架质粒pAdEasy ‑1同源重组， 得到重组 腺病毒质粒； （3） 在2 93A细胞中对重组腺病毒质粒进行包 装。 8.根据权利要求2 ‑6所述的溶瘤腺病毒在制备肿瘤药物中的用途， 其特征在于， 所述肿 瘤药物用于光动力治疗。 9.一种药物， 其特 征在于， 它包 含权利要求2 ‑6中任一项所述的溶瘤腺病毒。 10.根据权利要求9所述的药物， 其特征在于， 所述溶瘤腺病 毒用在光动力治疗前， 或用 在光动力和放、 化疗组合应用前， 或用在肿瘤免疫 治疗前。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114164186 A 2一种溶瘤腺病毒 、 其构建方法及其应用 技术领域 [0001]本发明属于基因工程领域， 具体涉及一种溶瘤腺病毒、 其构建方法及其应用。 背景技术 [0002]肿瘤光动力治疗(photodynamic  therapy， PDT)是临床治疗肿瘤的新方法,其利用 光源靶向性， 选择性消灭原发、 复发肿瘤， 避免正常组织损伤,提高患者生活质量； 同时也可 作为肿瘤手术切除后辅助治疗手段， 减少残留肿瘤细胞的存活。 PDT 可作用于各种类型的肿 瘤细胞， 因而应用广泛。 PDT主要由3个重要部分组成 ： 特定波长的光、 光敏剂 (photosensitizer， PS)和氧气,在治疗 过程中， 三者相互作用， 产生具备细胞毒性的活性氧 (reactive  oxygen species， ROS)， 通过凋亡或坏死机制杀 死肿瘤细胞。 [0003]光动力反应的过程中组织部位的氧气浓度决定了光动力反应的疗效， 但是肿瘤快 速生长使 血液供应不 足产生低氧细胞， 导致肿瘤组织普遍乏氧， 而PDT过程中局部氧气供应 消耗加重肿瘤缺氧， 严重影响P DT的疗效。 [0004]光敏剂是PDT的另一个关键要素， 光敏剂包括有化学光敏剂和蛋白质光敏剂， 化学 光敏剂有已实践应用的卟啉类光敏剂， 公开号为CN102174478A,名称为一种光敏剂结合蛋 白/多肽及其在光动力基因治疗中的应用， 就公开其从人肝cDNA噬菌体展示库中筛选一种 光敏剂结合蛋白， 该光敏剂结合蛋白可以在体外和卟啉类光敏剂结合， 并通过腺病毒或慢 病毒或其他方式转染该光敏剂结合蛋白基因于各种哺乳细胞， 经过人工调控诱导表达后产 生光动力学治疗效果。 然而， 化学光敏剂因其光毒性的延迟作用会导致长时间的皮肤光敏 性和色素沉着， 严重制约肿瘤光动力的效果。 蛋白质光敏剂可被蛋白酶水解而及时清除， 所 以可大大降低PDT的副作用， 在目前的肿瘤光动力治疗中已有蛋白质光敏剂的研究， 例如 KillerRed蛋白质光敏剂。 [0005]溶瘤腺病毒(oncolytic  virus)指一类天然或经基因工程改造具有选择性杀伤肿 瘤细胞功能的复制选择性溶瘤 腺病毒(replic ation‑selective  oncolytic  virus)， 其已 成为肿瘤靶向治疗研究和临床应用热点。 腺病毒作为一种 溶瘤腺病毒， 显示出较高的抗肿 瘤应用前景。 然而， 未经改造的腺病毒却存在 靶向肿瘤细胞能力差的问题。 专利申请公开号 为CN 111212656  A， 名称为溶瘤腺病毒载体及其用途， 公开了通过将微小RNA(miRNA)靶序 列插入病毒基因组中来进行病毒复制限制， 并且可应用于光动力治疗肿瘤中， 然而并没有 解决光动力治疗中缺氧的问题。 [0006]为了解决上述问题， 我们一 直在寻求一种理想的技 术解决方案 。 发明内容 [0007]本发明的目的是针对现有技术的不足， 从而提供一种光动力学治疗效果好的溶瘤 腺病毒、 其构建方法及 在肿瘤治疗药物中的用途。 [0008]本发明的技术方案为： 一种溶瘤腺病毒， 其特征在于， 其以pAdEasy ‑1腺病毒为基 础,插入有E1A、 CAT基因和蛋白质光敏剂基因。说　明　书 1/5 页 3 CN 114164186 A 3