(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111303004.3 (22)申请日 2021.11.05 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113943747 A (43)申请公布日 2022.01.18 (73)专利权人 中国水稻研究所 地址 310006 浙江省杭州市体 育场路359号 (72)发明人 吴丽娟　鄂志国　张治针　王磊　 王惠梅　 (74)专利代理 机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 专利代理师 沈金龙 (51)Int.Cl. C12N 15/74(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 17/16(2006.01) C07D 405/06(2006.01) A61K 31/4525(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (56)对比文件 CN 109234211 A,2019.01.18 CN 113461789 A,2021.10.01 Sarah P. N iehs等.I nsect-As sociated Bacteria As semble the Antifung al Butenolide Gladi ofungin by Non-Canonical Polyketide C hain Termination. 《Angewandte Chemie》 .2020,第59卷 张博等.戊二 酰亚胺类天然产物生物合成研 究进展. 《卫生学通报》 .2021,第48卷(第7期), Wu,L..Burkholderia sp. JP2-270 chromosome 3, complete sequence. 《GenBan k database》 .2018, Dawei So ng等.Complete gen ome sequence of Burkho lderia sp. JP2-270, a rhizosphere iso late of rice w ith antifung al activity a gainst Rhizocto nia solani. 《Microbial Pathogenesis》 .2018,第 127卷 Kaitlin E. Creamer等.Phyl ogenetic analysis of the sal inipostin γ- butyrolactone gene cluster uncovers new potential for bacterial signal ling- molecule diversity. 《Microbial Gen omics》 .2021,第7 卷 (续) 审查员 於娟 (54)发明名称 一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍 尔德氏菌及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于生产双氢剑兰制霉 菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法， 涉及基因 工程和代谢工程领域。 所述用于生产双氢剑兰制 霉菌素的伯克霍尔德氏菌， 命名为伯克霍尔德氏 菌JP2‑270Δ38940， 是将伯克霍尔德氏菌JP2 ‑ 270中DM992_38940基因敲除， 获得用于生产双氢 剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。 本发明提供的 一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯 克霍尔德氏菌产生的双氢剑兰制霉菌 素量大， 且该双氢剑 兰制霉菌素具有更好的抗肿瘤作用， 特别是对胶 质瘤具有更好的活性， 在制备治疗肿瘤疾病药物 方面具有潜在价 值。 [转续页] 权利要求书2页 说明书7页 序列表7页 附图11页 CN 113943747 B 2022.08.09 CN 113943747 B (56)对比文件 Ioanna T. Nak ou等.Gen omics-Driven Discovery of a N ovel Glutarimide Antibiotic from Burkho lderia gladi oli Reveals an Unusual Po lyketide Synthase Chain Release Mec hanism. 《Angewandte Chemie》 .2020,第59卷 王渭霞等.昆虫共生 微生物及其功能研究进 展. 《昆虫 学报》 .2021,第64卷(第1期),2/2 页 2[接上页] CN 113943747 B1.一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌( Burkholderia  sp. )， 命名为 伯克霍尔德氏菌JP2 ‑270Δ38940， 由伯克霍尔德氏菌JP2 ‑270敲除了DM992_38940基因得 到， 所述伯克霍尔德氏菌JP2 ‑270保藏编号为CCTCC  NO： M 2018703， 双氢剑兰制霉菌素的化 学结构式如式 Ⅰ所示： DM992_38940基因的DNA序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌， 其特征在于， 将基 因序列如SEQ  ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如SEQ  ID NO.4所示的插入 基因片段38940dw同时连接至制备的线性化pK18mobSacB载体上， 制备用于DM992_38940基 因敲除质粒pK18 ‑38940， 将质粒pK 18‑38940转入伯克霍尔德氏菌JP2 ‑270感受态细胞， 筛选 获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌， 其中质粒pK18 ‑38940的基因序列如 SEQ ID NO.5所示。 3.如权利要求1或2所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌在制备双氢剑 兰制霉菌素中的应用； 所述双氢剑兰制霉菌素的化学 结构式如式 Ⅰ所示： 4.权利要求1所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌的制备方法， 其特征 在于， 将伯克霍尔德氏菌JP2 ‑270中DM992_38940基因敲除， 获得用于生产双氢剑兰制霉菌 素的伯克霍尔德氏菌 。 5.如权利要求4所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌的制备方法， 其特 征在于， 基因敲除时， 将基因序列如SEQ  ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列 如SEQ ID NO.4所示的插入基因片段38940dw同时连接到制备的线性化pK18mobSacB载体 上， 制备用于基因敲除的质粒pK18 ‑38940， 将质粒pK18 ‑38940转入伯克霍尔德氏菌JP2 ‑270 感受态细胞， 筛 选得到用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌 。 6.一种用于制备双氢剑兰制霉菌素的方法， 其特征在于， 发酵培养权利要求1或2所述 用于生产双氢剑兰制霉菌素 的伯克霍尔德氏菌后， 将获得 的发酵液采用乙酸乙酯抽提， 抽 提液进行旋转蒸发并收集沉淀物， 沉淀物用甲醇溶液溶解后得到粗提物； 粗提物依次经 Sephadex  LH‑20色谱柱分离和ODS柱纯化得到双氢剑兰制霉菌素； 所述双氢剑兰制霉菌素权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113943747 B 3