(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111346320.9 (22)申请日 2021.11.15 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新 技术开发 区科学大道100号 (72)发明人 侯琳　张振中　杨静　张萌　 王芮婷　张红岭　何玉萍　 (74)专利代理 机构 郑州天阳专利事务所(普通 合伙) 41113 代理人 李松莲 (51)Int.Cl. A61K 9/51(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 45/00(2006.01)A61K 47/69(2017.01) A61K 47/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复 合物的制备方法及其应用 (57)摘要 一种癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复 合物的制备方法及其应用， 利用介孔锌铁氧化物 纳米粒物理负载DNA损伤药物， 然后将癌细胞膜 包裹其表 面， 构成癌细胞膜包裹锌铁氧化物纳米 复合物， 具体包括以下步骤： （1） 、 制备锌铁氧化 物纳米粒； （2） 、 制备负载DNA损伤药物的锌铁氧 化物纳米复合物； （3） 、 制备癌细胞膜包裹载药锌 铁氧化物纳米复合物； 本发明操作方便， 方法稳 定可靠， 所制得的癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物 纳米复合物具有生物相容性好、 毒副作用小等优 点， 在肿瘤治疗方面可发挥靶向、 激活cGAS ‑ STING通路达到免疫治疗的作用， 是肿瘤免疫治 疗药物上的创新， 经济和社会效益巨大。 权利要求书3页 说明书5页 CN 113995732 A 2022.02.01 CN 113995732 A 1.一种癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复合物的制备方法， 其特征在于， 利用介孔 锌铁氧化物纳米粒物理负载DNA损伤药物， 然后 将癌细胞膜包裹其表面， 构成癌细胞膜包裹 锌铁氧化物纳米复合物， 具体包括以下步骤： （1） 、 制备锌铁氧化物纳米粒： 将1～3mmol  FeCl3·6H2O和0.5～1.5mmol  ZnCl2溶解在 40mL乙二醇中， 得溶液， 然后加入1.8～5.4g的NaAc和1.0g聚乙二醇， 将混合物剧烈搅拌 30min， 然后密封在特氟隆衬里高压釜中， 再放入马弗炉中密封， 160 ‑200°C反应12～20h， 随 后将高压釜冷却至室温， 用磁体 收集固体产物， 固体产物分别用蒸馏水和乙醇洗涤3次， 得 样品， 将样品在真空烘 箱中75‑85℃干燥7.5 ‑8.5h， 得锌铁氧化物纳米粒； （2） 、 制备负载DNA损伤药物的锌铁氧化物纳米 复合物： 将步骤 （1） 制备的锌铁氧化物纳 米粒2～5mg分散于pH7.4的PBS缓冲液3～6mL中， 形成第一混合液； 将4～10mg  DNA损伤药物 分散于1～2  mL溶剂中， 形成第二混合液； 将第二混合液在搅拌下滴加 于第一混合液中， 室 温搅拌24h， 然后12 000～15000rpm离心10～2 0 min， 真空70 ‑80℃干燥5 ‑6h， 得负载DNA损伤 药物的锌铁氧化物纳米复合物； 所述的DNA损伤药物为 紫杉醇、 阿霉素或铂类药物中的一种； 所述溶剂为超纯 水、 pH=7 .4的PBS缓冲液、 无 水乙醇、 DMSO或甲酰胺的一种； （3） 、 制备癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复合物： 通过差速离心法提取癌细胞膜， 将细胞以660g离心10min， 并用pH7.4的PBS  洗涤3次， 将细胞沉淀重悬在低渗裂解 缓冲液中 进行机械破坏， 以3200g离心5min， 收集上清液， 并重复该过程， 将细胞再次以3200g离心 6min， 合并上清液， 在4  ℃条件下以  21000g离心25min， 收集上清液， 将上清液在超 高速离 心机中4℃条件下以45000g离心5min， 弃去上清液， 用BCA蛋白质定量试剂盒对提取的细胞 膜碎片进行量化， 将步骤 （2） 制备的负载DNA损伤药物的锌铁氧化物纳米复合物分散于pH   7.4的PBS中， 与制备的细胞膜以1： 0.125～4的质量比混合， 在水浴超声仪中将混合物超声 处理28‑32min， 通过聚碳酸酯膜挤压5～15次， 得产物， 将产物12000～15000rpm离心10～20   min， 即得癌细胞膜包裹载 药锌铁氧化物纳米复合物； 所述的低渗裂解缓冲液是由20mM  Tris‑HCl、 10mM  KCl、 2mM MgCl2和1mM PMSF混合制 成。 2.根据权利要求1所述的癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复合物的制备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） 、 制备锌铁氧化物纳米粒： 将3mmol  FeCl3·6H2O和1.5mmol  ZnCl2溶解在40mL乙二 醇中， 得溶液， 然后加 入1.8g的NaAc和1.0  g聚乙二醇， 将混合物剧烈搅拌30min， 然后密封 在特氟隆衬里高压釜中， 再放入马弗炉中密封， 200 °C反应12h， 随后将高压釜冷却 至室温， 用磁体收集固体产物， 固体产物分别用蒸馏水和乙醇洗涤3次， 得样品， 将样品在真空烘箱 中75℃干燥8.5 h， 即得锌铁氧化物纳米粒； （2） 、 制备负载紫杉醇的锌铁氧化物纳米复合物： 将步骤 （1） 制备的锌铁氧化物纳米粒 2mg分散于pH7.4的PBS缓冲液3mL中， 形成第一混合液； 将4  mg紫杉醇分散于1mL无水乙醇 中， 形成第二混合液； 将第二混合液在搅拌下滴加于第一混合液中， 室温搅拌24h， 然后 12000rpm离心 20min， 真空70℃干燥6 h， 得负载紫杉醇的锌铁氧化物纳米复合物； （3） 、 制备癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复合物： 通过差速离心法提取癌细胞膜， 将细胞以660g离心10min， 并用pH  7.4的PBS洗涤3次， 将细胞沉淀重悬在低渗裂解 缓冲液中权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 113995732 A 2进行机械破坏， 以3200g离心5min， 收集上清液， 并重复该过程， 将细胞再次以3200g离心 6min， 合并上清液， 在4  ℃条件下以  21000g离心25min， 收集上清液， 将上清液在超 高速离 心机中4℃条件下以45000g离心5min， 弃去上清液， 用BCA蛋白质定量试剂盒对提取的细胞 膜碎片进行量化， 将步骤 （2） 制备的负载紫杉醇 的锌铁氧化物纳米复合物分散于pH  7.4的 PBS中， 与制备的细胞膜以1： 1的质量比混合， 在水浴超声仪中将混合物超声处理28min， 通 过聚碳酸酯膜挤压7次， 得产物， 将产物12000rpm离心20  min， 即得癌细胞膜包裹载药锌铁 氧化物纳米复合物。 3.根据权利要求1所述的癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复合物的制备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） 、 制备锌铁氧化物纳米粒： 将2mmol  FeCl3·6H2O和1mmol  ZnCl2溶解在40mL乙二醇 中， 得溶液， 然后加入3.6g的NaAc和1.0g聚乙二醇， 将混合物剧烈搅拌30min， 然后密封在特 氟隆衬里高压釜中， 再放入马弗炉中密封， 180 °C反应16h， 随后将高压釜冷却 至室温， 用磁 体收集固体产物， 固体产物分别用蒸馏水和乙醇洗涤3次， 得样品， 将样品在真空烘箱中80 ℃干燥7h， 得锌铁氧化物纳米粒； （2） 、 制备负载阿霉素的锌铁氧化物纳米复合物： 将步骤 （1） 制备的锌铁氧化物纳米粒 4mg分散于pH7.4的PBS缓冲液5mL中， 形成第一混合液； 将7mg阿霉素分散于1mL超纯水中， 形 成第二混合液； 将第二混合液在搅拌下滴加于第一混合液中， 室温搅拌24h， 然后13500rpm 离心15 min， 真空75℃干燥5.5 h， 得负载阿霉素的锌铁氧化物纳米复合物； （3） 、 制备癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复合物： 通过差速离心法提取癌细胞膜， 将细胞以660g离心10min， 并用pH  7.4的PBS洗涤3次， 将细胞沉淀重悬在低渗裂解 缓冲液中 进行机械破坏， 以3200g离心5min， 收集上清液， 并重复该过程， 将细胞再次以3200g离心 6min， 合并上清液， 在4  ℃条件下以  21000g离心25min， 收集上清液， 将上清液在超 高速离 心机中4℃条件下以45000g离心5min， 弃去上清液， 用BCA蛋白质定量试剂盒对提取的细胞 膜碎片进行量化， 将步骤 （2） 制备的负载阿霉素的锌铁氧化物纳米复合物分散于pH  7.4的 PBS中， 与制备的细胞膜以1： 2的质量比混合， 在水浴超声仪中将混合物超声处理30min， 通 过聚碳酸酯膜挤压11次， 得产物， 将产物13500rpm离心15  min， 即得癌细胞膜包裹载药锌铁 氧化物纳米复合物。 4.根据权利要求1所述的癌细胞膜包裹载药锌铁氧化物纳米复合物的制备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） 、 制备锌铁氧化物纳米粒： 将1mmol  FeCl3·6H2O和0.5mmol  ZnCl2溶解在40mL乙二 醇中， 得溶液， 然后加入5.4g的NaAc和1.0g聚乙二醇， 将混合物剧烈搅拌30min， 然后密封在 特氟隆衬里高压釜中， 再放入马弗炉中密封， 200 °C反应12h，