(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111328929.3 (22)申请日 2021.11.10 (71)申请人 苏州大学 地址 215000 江苏省苏州市吴中区石湖西 路188号 (72)发明人 张洪建　周志芸　段泽琳　 (74)专利代理 机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通 合伙) 32257 代理人 王玉仙 (51)Int.Cl. C12Q 1/02(2006.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 31/55(2006.01) A61K 31/513(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种筛选谷氨 酰胺转运蛋白抑制剂的方法、 采用该方法筛 选出的抑制剂及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种筛选谷氨酰胺转运蛋白抑 制剂的方法， 并基于该人源谷氨 酰胺转运蛋白抑 制剂筛选体系筛选出了一种新的谷氨酰胺转运 蛋白抑制剂米安色林， 为米安色林拓展了新的应 用领域。 本发明公开了米安色林的新用途， 该化 合物有助于临床上针对多种肿瘤预防和治疗药 物的开发。 权利要求书1页 说明书13页 序列表2页 附图8页 CN 114107426 A 2022.03.01 CN 114107426 A 1.一种筛 选谷氨酰胺转 运蛋白抑制剂的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)将人源SLC1A5稳定转染细胞株和HEK293野生型细胞培养至对数增长期时进行铺 板， 更换培液为不含谷氨酰胺的培液， 加入待测化合物进行预孵育， 去除培液， 加入由不含 谷氨酰胺的培液配制的氘代谷氨酰胺和待测化 合物进行孵 育； 所述人源SLC1A5稳定转染细胞株是将人源化SLC1A5基因插入至HEK293细胞中得到的 细胞株； (2)检测每孔细胞内氘代谷氨酰胺的含量和蛋白浓度， 再将每孔细胞内氘代谷氨酰胺 的含量用蛋白浓度进 行归一化处理， 根据细胞对氘代谷氨酰胺的摄取量筛选出待测化合物 中的谷氨酰胺转 运蛋白抑制剂。 2.根据权利要求1所述的人源SLC1A5稳定转染细 胞株， 其特征在于： 在步骤(1)中， 所述 人源SLC1A5稳定转染细胞株以pcDNA5 ‑TO为表达载体。 3.根据权利要求1所述的人源SLC1A5稳定转染细 胞株， 其特征在于： 在步骤(1)中， 不含 谷氨酰胺的培液 预孵育时间为12 ‑20h。 4.根据权利要求1所述的人源SLC1A5稳定转染细 胞株， 其特征在于： 在步骤(1)中， 氘代 谷氨酰胺的终浓度为5 0‑150 μM。 5.米安色林在作为谷氨酰胺转 运蛋白抑制剂的应用。 6.米安色林在制备抗肿瘤药物中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于： 所述肿瘤为与谷氨酰胺转运有关的实体肿 瘤。 8.一种抗肿瘤药盒， 其特 征在于， 所述药盒包括含有米安色林的制剂。 9.根据权利要求8所述的抗肿瘤药盒， 其特征在于： 所述药盒还包括含有氟尿嘧啶 的制 剂。 10.根据权利要求8所述的抗肿瘤药盒， 其特征在于： 所述肿瘤为结直肠癌、 胰腺癌、 肝 癌或回盲肠癌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107426 A 2一种筛选谷氨 酰胺转运蛋白抑制剂的方 法、 采用该方 法筛选 出的抑制剂及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物医药技术领域， 尤其涉及 一种筛选谷氨酰胺转运蛋白抑制剂的方 法、 采用该 方法筛选出的抑制剂及其应用。 背景技术 [0002]肿瘤细胞为了适应增殖和转移过程中的生物合成和氧化还原需求， 会重新调整细 胞代谢， 以满足能量(葡萄糖)、 氨基酸、 脂肪酸和其他营养物质的需求。 研究表明， 干扰或阻 断某些代谢途径(例如谷氨酰胺代谢)可以有效逆转肿瘤细胞对抗肿瘤 疗法的耐药。 谷氨 酰 胺是血浆中最丰富的非必需中性氨基酸， 可以由饮食分解获得或者在肌肉、 肝脏、 脂肪组 织、 肺和大脑中生 成， 是许多代谢过程中的关键中间体， 包括能量形成、 氧化还原稳态、 大分 子合成和信号传递等。 在快速生长或疾病期间， 细胞对谷氨 酰胺的需求会超过其供应， 谷氨 酰胺便会从非必需氨基酸变为必需氨基酸， 因此肿瘤细胞谷氨酰胺成瘾是一种代谢补偿， 间接促进了氧化糖酵解， 以便在缺氧不利条件下为肿瘤 细胞提供 营养和能量。 [0003]谷氨酰胺代谢的关键步骤是SLC1A5(ASCT2)介导的细胞摄取： SLC1A5是Na+依赖的 跨膜转运蛋白， 属于SLC转运蛋白超家族， 是肿瘤微环 境(TME)中肿瘤细胞的代谢弱点之一。 研究发现， SLC1A5的抑制或缺 失会导致肿瘤细胞内谷氨 酰胺含量降低， 使其缺乏能源物质， 最终导致肿瘤的生长受到抑制 。 因此， 在肿瘤细胞中， 阻断或减少谷氨酰胺的摄取， 可能达 到抑制住肿瘤细胞生长增殖的作用， 提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。 基于这个假设， 将谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5作为潜在新型靶点， 探讨通过调控SLC1A5转运功能治疗癌症的 可能性。 [0004]SLC1A5是特异性谷氨酰胺的转运体， 目前已经开发出一些S LC1A5摄取转运谷氨酰 胺的抑制剂， 而开发新型的基于小分子化合物的SLC1A5抑制剂意义重大， 将为肿瘤的治疗 提供更多的药物和方法。 该转运体抑制剂的设计及筛选可以通过某些表达SLC1A5的肿瘤细 胞完成。 但这种筛选方法具有特异性差、 通量低、 成本高的缺点， 因此建立一种合理的抑制 剂筛选体系意 义重大。 发明内容 [0005]为解决上述技术问题， 本发明提供了一种人源SLC1A5稳定转染细胞株， 并应用此 细胞株建立了一种筛 选方法， 筛 选出了一种新的谷氨酰胺转 运蛋白抑制剂。 [0006]本发明中， 谷氨酰胺转运蛋白抑制剂通过人源SLC1A5稳定转染细胞株进行筛选， 该细胞株的构建方法包括以下步骤： 将人源化SLC1A5基因插入至HEK293细胞中得到的细胞 株， 具体的， [0007](1)将hSLC1A5基因与pcDNA5 ‑TO(Hygromycin/Ampicillin)表达载体组装， 构建 pcDNA5‑TO‑hSLC1A5质粒； 其中， 从基因库获得hSLC1A5基因序列(NM_005628.3)， 其核苷酸 序列如SEQ IDNO.1所示；说　明　书 1/13 页 3 CN 114107426 A 3