ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 31807—2015 棉花根腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phymatotrichopsis omnivora (Duggar) Hennebert 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31807—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：张慧丽、张卫东、段维军、徐瑛、陈先锋、崔俊霞、杜洪忠、吴品珊。 I GB/T31807—2015 棉花根腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了棉花根腐病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于棉花根腐病寄主植物的植株、种子及介质的检疫鉴定 2仪器设备和主要试剂 2.1仪器设备 显微镜、解剖镜、天平（感量1/100g，1/10000g）、pH计、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心 机、高速冷冻离心机、低温冰箱、冷藏冷冻冰箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪 微量移液器（2μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）。 2主要试剂 2.2 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。包括无菌双蒸水、次氯酸钠、液氮、蛋白酶K、氯化镁、氢氧 化钠、醋酸铵、氯化钾、无水乙醇、溴化乙锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、TaqDNA聚合酶、dNTP混合 物、1OXPCR缓冲液、琼脂糖、DNA相对分子质量标准物、CTAB、Tris/EDTA/SDS提取缓冲液 （TES）、Tris硼酸盐EDTA缓冲液（TBE）、Tris/EDTA缓冲液（TE）等。分离培养基、产孢培养基、马 铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）配制方法及步骤见附录C。 3病菌的鉴定 3.1症状检查 将可疑植株的根部在解剖镜下镜检，将带有菌丝索或菌核的病根挑出。种子类样品，从中挑选夹带 的植株残体，尤其是根部病残体。介质土借助湿筛挑出其中的菌核（参见附录B）。 3.2病原菌的分离培养 3.2.1病根上菌丝索的分离培养 在解镜下，将病根上覆盖的菌丝索挑下，用无菌水洗涤菌丝片段，洗净后置于分离培养基上， 28℃黑暗培养，每天观察，待长出菌丝后，挑取菌丝尖端转移到PDA平板上纯化。 3.2.2病残体上病原菌的分离培养 在自来水下将病残体洗净，切取病健交界处组织，用1%次氯酸钠进行表面消毒3min，无菌水冲洗 3次，灭菌滤纸吸干表面水分后，置于分离培养基上，28℃黑暗培养，每天观察，待长出菌丝后，挑取菌 丝尖端转移到PDA平板上纯化。 3.2.3菌核上病原菌的分离培养 菌核上病原菌的分离培养方法同3.2.2。 1 GB/T31807—2015 3.3分生孢子的诱导 将纯化好的菌株接种到产孢培养基上，28℃，每天光照16h。每天观察，待产孢后，显微镜下观察 分生孢子的形态特征。 3.4PCR鉴定方法 PCR鉴定方法见附录D。 4鉴定特征 4.1米 症状特点 寄主植物受侵染后，根的表面覆盖有棕褐色至金黄色菌丝索（参见B.1），根部变软、腐烂、皮层易剥 落，中柱变色或出现红褐色病斑（参见B.1），有时根表面还可以看到棕色至黑色的菌核。 4.2 2病菌的形态特征 病菌在PDA平板上菌落初为白色，后变为污黄色（参见B.2）。分生孢子梗球形或椭圆形，大小 子，外观上类似“担子”（参见B.2）。分生孢子单胞，透明，球形或卵圆形，着生于多分枝的菌丝上，直径 4.8μm~5.5μm或（6μm~8μm）×（5μm~6μm）（参见B.2）。菌丝索褐色，直径约200μm，成直角伸 出侧枝，侧生菌丝呈十字形分枝（参见B.2）。菌核棕色或黑色，圆形或不规则形，直径1mm～5mm，单 生或串生，萌发后长白色菌丝，后变污黄色（参见B.3）。 4.3PCR特异性扩增 P.omnivora的特异性扩增片段为627bp。 5结果判定 及形态特征与第4章各项鉴定指标吻合，判定为棉花根腐病菌，分离物的为害症状及形态特征不明显的 情况下，分离物需要进行PCR鉴定，PCR特异性扩增阳性，可判为棉花根腐病菌。 6 样品保存与结果记录 6.1 样品保存与处理 经检验确定携带棉花根腐病菌的样品，视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月，以备 复核。保存期满后，应经灭菌处理。 6.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为棉花根腐病菌的菌株，应妥善保存。对不需要长期保存的菌株应及时 高压灭菌处理。 2 GB/T 31807—2015 6.3 结果记录与资料保存 需要保存的记录包括：样品的种类、自然状态、来源、被为害症状及为害程度（无症状也要说明），诊 的名称，负责人和鉴定人的签字等。 3